עם כ-100 מיליון תאים במוח העכבר וגדלים של תמונות ברזולוציה תאית של מוח שלם המתקרבים לסולם טרה-בייט, יש צורך בכלי ניתוח תמונה מתקדמים כדי לכמת במדויק תאים. הצינור החישובי שלנו יכול לעבד מראש תמונות ולכמת גרעינים בתוך קליפת המוח של העכבר תוך שמירה על פשרה סבירה בין דיוק זיהוי התאים, זמן ההדמיה והמשאבים החישוביים. מי שידגימו את ההליך יהיו פליקס קייר ואיאן קרטין, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, הרכב את הדגימה במחזיק גודל המדגם הנכון כך שהמדגם מכוון עם ממד z לא יותר מ 5.2 מילימטרים בעומק בשל מרחק העבודה המדורג של מיקרוסקופ UltraMicroscope II. לאחר מכן הכנס את המחזיק לעריסת הדגימה כך שהבורג של המחזיק נמצא בזווית של 45 מעלות לתמיכות העריסה. לאחר מכן, מקם את העריסה במיקום כך שהדגימה מכוונת בניצב לנתיב האור.
לאחר מכן, הגדר את גוף הזום במיקרוסקופ להגדלה של פי 4 ומעלה, והניב 0.75 מיקרומטר לפיקסל. בתוכנת Inspector Pro, בחר גיליון אור יחיד עם ערך צמצם מספרי של כ- 0.08. כדי להבטיח שמירה על רזולוציה צירית לאורך רוחב התמונה, בחרו 'מיקוד דינמי אופקי' והחלו את מספר הצעדים המומלץ בהתאם לאורך גל הלייזר.
לאחר מכן התאם את המיקוד העדין עבור כל ערוץ ביחס לערוץ הרישום ועוצמת הלייזר לערוץ ביחס למאפייני הערוץ. לאחר מכן, התאם את רוחב גיליון האור לכ-50% כדי להבטיח שעוצמת הגיליון תחולק בצורה אופטימלית בממד y עבור גודל המדגם. לאחר מכן, הגדר את מספר האריחים ביחס לגודל המדגם עם חפיפה מומלצת של 15% בין אריחים, ולכוד תמונות עבור כל ערוץ ברצף עבור כל ערימה במיקום אריח נתון.
ראשית, הורד והתקן את מנהל הסביבה של Conda עבור לינוקס וכלי עיבוד תמונה NuMorph. בשורת הפקודה, הפעל את matlab ו- NM_setup. m מ NuMorph כדי להוריד ולהתקין חבילות תוכנה לניתוח תמונות הדרושות לניתוח.
לאחר מכן ציין שמות לדוגמה, ספריות קלט ופלט, פרטי ערוץ ופרמטרים של הדמיית גיליון אור על-ידי עריכת הקובץ NM_samples.m. להתאמת עוצמה, ב- NMp_template, הגדר את ההתאמה ל- true ו- use_processed_images כ- false בעת עבודה עם ערכת תמונות חדשה. לאחר מכן, הגדר את save_images ואת save_samples כאמת.
לאחר מכן, הגדר את הצללת האריחים לבסיסית כדי להחיל תיקון הצללה באמצעות האלגוריתם הבסיסי, או ידנית להחלת תיקון הצללת אריחים באמצעות מדידות מ- UltraMicroscope II ברוחב גיליון אור ספציפי. ליישור ערוץ תמונה, ב- NMp_template, הגדר channel_alignment ל- true ואת alignment_method הערוץ לתרגום או לגלסטיות. לאחר מכן, הגדר sift_refinement כערך true וערך חפיפה של 0.15 כדי להתאים לחפיפת אריחים במהלך ההדמיה.
כדי להפעיל שלבי עיבוד מקדים ב- MATLAB, ציין את שם הדגימה והגדר את התצורה NM_config דגימת תהליך. לאחר מכן הפעל כל אחד משלבי העיבוד המקדים על-ידי ציון תפר תצורה NM_process תוך ציון השלב באמצעות עוצמה, יישור או תפירה, ובדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט עבור כל אחד מהשלבים. התחל עם תמונת אטלס תלת-ממדית ותמונת ביאור משויכת המקצה כל ווקסל למבנה מסוים.
יישר הן את תמונת Atlas והן את קובץ הביאור כדי לוודא שהם תואמים כהלכה בכיוון הנכון. לאחר היישור, עבד את הקבצים ב- NuMorph כדי לציין את הקלטים כמתואר בכתב היד על-ידי ביצוע הפקודה. בשנת NMa_template, הגדר resample_images ל- true ו- resample_resolution להתאים לאטלס.
לאחר מכן ציין את מספר הערוץ שיידגם מחדש באמצעות resample_channels. לאחר מכן, הגדר את register_images ל- true, ציין את atlas_file שיתאים לקובץ בספריית Atlas והגדר את registration_parameters כברירת מחדל. לאחר מכן הגדר את save_registered_images כ- true.
עבור זיהוי גרעינים, ספירת תאים וסיווגם, הגדר הן count_nuclei והן classify_cells כאמת. לאחר מכן הגדר את count_method ל- 3dunet ו- min_intensity כדי להגדיר סף עוצמה מינימלי עבור אובייקטים שזוהו. לאחר מכן, הגדר classify_method לסף המבוסס על עוצמת פלואורסצנטיות לא מפוקחת במיקומים צנטרואידים, או SVM אשר מדגים מסווג מכונת וקטור תמיכה ליניארית מפוקחת.
כדי לבצע שלבי ניתוח ב- MATLAB, ציין את שם הדגימה והגדר את התצורה לניתוח דגימה NM_config. לאחר מכן, הפעל כל אחד משלבי הניתוח על-ידי ציון שלב קביעת התצורה NM_analyze תוך ציון השלב באמצעות דגימה מחדש, רישום, ספירה או סיווג ובדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט עבור כל אחד מהשלבים. ב- NMe_template, הגדר את העדכון ל- true ואת compare_structures_by- לכל אחד מהאינדקסים.
לאחר מכן הגדר את קובץ התבנית ואת טבלת המבנה, המציינת את כל האינדקסים והמבנים האפשריים למבנה להערכה, תוך ציון ספירת תאים וסיווג סוגי תאים. ניקוי רקמות באמצעות פרוטוקול iDISCO+ וסמני גרעינים ספציפיים לשכבה העצבית הביא לקבוצות תאים מוגדרות בבירור של נוירונים בשכבה העליונה והתחתונה באיזוקורטקס. ספירת תאים באמצעות NuMorph הייתה תלויה בשלבי עיבוד מקדים מוצלחים שכללו התאמת עוצמה, יישור ערוצים ותפירה.
עם זאת, שגיאות בשלבי העיבוד המקדים עלולות לגרום לתפירה לא נכונה, מה שיוביל ליישור ותפירה לא תקינים, וכך לגרום לתמונות עם דפוס לא ממוקד ולא ממוקד. על מנת לספור גרעינים מאזורי מוח ספציפיים, התמונות התפורות יעברו ביאורים באמצעות אטלס, מה שיאפשר לכסות ביאורים על אזורי המוח. הצנטרואידים של הגרעינים זוהו באמצעות מודל U-Net תלת-ממדי מאומן ב-NuMorph עם כ-12 מיליון גרעינים סה"כ שהיו TO-PRO-3-חיוביים באיזוקורטקס עם כ-2.6 מיליון גרעינים חיוביים למוח ו-1.6 מיליון גרעינים חיוביים ל-CTIP2.
כ-3.7 ו-2.9 מיליון גרעינים חיוביים ל-TO-PRO-3 בסך הכל בגרעיני הבסיס ובאלוקורטקס בהיפוקמפוס זוהו, בהתאמה. עם זאת, התאים הדו-חיוביים במוח שזוהו בשני אזורי המוח האלה היו זניחים, ורק כ-1.5 מתוך פחות ממיליון תאים חיוביים ל-CTIP2 זוהו כל אחד בגרעיני הבסיס ובאלוקורטקס בהיפוקמפוס. בצע בדיקות איכות חזותיות במהלך הרכישה כדי להשיג פילוח טוב.
והגדר כראוי את סביבת Conda כדי להבטיח שלא ייתקלו בשגיאות בניתוח במורד הזרם. בנוסף לספירת תאים, צינור זה מאפשר אינטגרציה עם כלי סגמנטציה אחרים המודדים את גודל התא וצורתו, אשר לאחר מכן ניתן להשוות בין קבוצות גנוטיפ. בעזרת הצינור שלנו, אנו יכולים לזהות כיצד האנטומיה של המוח משתנה ברזולוציה התאית, מה שמוביל לזיהוי סוגי תאים ואזורים במוח החשובים לסיכון למחלות.
