体内 小鼠海马体中小胶质细胞的慢性双光子成像

小胶质细胞在海马体中的作用尚未完全了解。该协议可以直接成像小胶质细胞如何接触和调节神经元。对海马体中静息的小胶质细胞和神经元进行体内成像非常困难。

这种方法可以解决这个问题。要植入观察窗，请使用真皮冲头在头骨上制作一个三毫米的圆形凹槽，确保凹槽与先前标记的区域对齐。当真皮冲头在接触下面的硬脑膜之前到达颅骨的最内层时，使用 30 号针轻轻抬起中央骨岛。

接下来，使用硬脑膜拾取器小心地去除硬脑膜。从表面吸出软脑膜、软脑膜血管和皮质组织。在整个颅窗上保持暴露组织表面的深度均匀，并逐渐加深抽吸，直到外囊的纤维暴露。

将吸头定位到颅窗前外侧端侧脑室附近的外囊后，去除在尾外侧向前外侧方向运行的外囊表层。然后去除沿中外侧方向运行的内层。通过检查肺泡表面和背海马连合的完全暴露来确认整个外部胶囊的去除。

确保出血完全停止后，用无菌盐水填充孔至颅骨表面的水平。接下来，将玻璃底金属管垂直插入孔中，同时吸出从管子侧面溢出的多余水，直到玻璃底部轻轻压在肺泡上并部分压平下面的 CA1。使用牙科树脂水泥，将插入管的壁固定在周围的颅骨上。

将鼠标放在双光子显微镜物镜下的头部固定装置中，并放在电动XY扫描载物台上。然后用水填充玻璃底部和物镜之间的空间，而不会产生气泡。在脉冲激光的连续照明下，在脑实质发出的荧光和金属管边缘的反射光的指导下，将焦点调整到CA1。

通过倾斜鼠标头固定装置来调整鼠标头的角度，使玻璃底部与成像平面平行。然后调整物镜的校正环，以在CA1中目标结构的深度处实现最高分辨率。接下来，确认齿状回或DG分子层中的荧光细胞在距玻璃底部500微米的深度在整个视野中成像。

只有在手术成功的情况下，才能立即检测到危险品信号。在单个外壳中举起术后小鼠数周。将麻醉小鼠置于双光子显微镜下。

进行海马体成像。确认术后水肿减少后拍摄的图像的质量和强度是否与手术当天捕获的图像更好或相当。确保小胶质细胞已恢复其分支形态。

然后在CA1中感兴趣的层上进行体内成像。手术后立即捕获的CX3CR1-GFP小鼠的小胶质细胞没有明显的激活。在没有诱导水肿的情况下成功手术后，双光子成像深度超过了整个CA1层，从手术表面达到500微米。

术后三周以上慢性期的小胶质细胞由于水肿和炎症减少，表现出更高的荧光强度和分辨率以及更均匀的分布。所有层中的小胶质细胞已经恢复了其分支形态，并表现出不动的细胞体和高度模态的过程。整个CA1的高分辨率图像提供了几个月。

来自荧光小胶质细胞的信号有助于识别海马层。肺泡中的小胶质细胞具有细长的细胞体和沿轴突束延伸的过程。金字塔层中的小胶质细胞可以通过其过程的较低密度来区分。

CA1和DG之间的边界可以通过沿边界运行的厚血管来识别，而用磺酰罗丹明101标记血管可以更好地识别。作为应用示例，GFP阳性小胶质细胞和tdTomato标记的锥体神经元同时成像。神经元标记有助于了解CA1的确切层结构。

最重要的一点是减少手术损伤。避免误吸对组织造成损伤。插入玻璃底部时施加轻微的压力，避免牙科水泥接触大脑表面。

这种方法将有助于确定小胶质细胞在海马体中的作用。例如，小胶质细胞如何与神经元相互作用，它们如何参与学习，以及它们如何控制脑部疾病。