Las funciones de la microglía en el hipocampo aún no se comprenden completamente. Este protocolo puede obtener imágenes directas de cómo la microglía contacta y regula las neuronas. Las imágenes in vivo de la microglía en reposo y las neuronas en el hipocampo han sido muy difíciles.
Este método puede resolver este problema. Para implantar la ventana de observación, haga un surco circular de tres milímetros en el cráneo utilizando un punzón dérmico, asegurando la alineación del surco con el área previamente marcada. Cuando el punzón dérmico alcance la capa más interna del cráneo antes de tocar la duramadre subyacente, levante suavemente la isla ósea central con una aguja de calibre 30.
A continuación, retire con cuidado la duramadre con un recolector de dura. Aspirar la pia, los vasos piales y el tejido cortical de la superficie. Mantenga la profundidad de la superficie del tejido expuesto homogénea en toda la ventana craneal y profundice gradualmente la aspiración hasta que las fibras de la cápsula externa queden expuestas.
Después de colocar la punta de succión en la cápsula externa cerca del ventrículo lateral en el extremo rostrolateral de la ventana craneal, retire la capa superficial de la cápsula externa que corre en la dirección caudomedial a la dirección rostrolateral. Luego retire la capa interna que corre en la dirección mediolateral. Confirme la extracción de toda la cápsula externa comprobando la exposición completa de la superficie del alvéo y la comisura dorsal del hipocampo.
Después de asegurarse de que el sangrado se haya detenido por completo, llene el orificio con solución salina estéril hasta el nivel de la superficie del cráneo. A continuación, inserte el tubo de metal del fondo de vidrio verticalmente en el orificio mientras aspira el exceso de agua que se desborda desde los lados del tubo hasta que el fondo de vidrio presione ligeramente contra el alveo y aplane parcialmente el CA1 subyacente. Usando el cemento de resina dental, fije la pared del tubo insertado al cráneo circundante.
Coloque el ratón en el dispositivo de sujeción de la cabeza debajo de la lente del objetivo del microscopio de dos fotones y en la etapa de escaneo XY motorizada. Luego llene el espacio entre el fondo de vidrio y la lente del objetivo con agua sin crear burbujas de aire. Ajuste el enfoque a CA1 con la guía de fluorescencia emitida por el parénquima cerebral y la luz reflejada desde el borde del tubo de metal bajo iluminación continua por el láser pulsado.
Ajuste el ángulo de la cabeza del ratón inclinando el dispositivo de sujeción de la cabeza para que el fondo del cristal quede paralelo al plano de imagen. Luego ajuste el collar de corrección del objetivo para lograr la resolución más alta a una profundidad de la estructura objetivo en el CA1. A continuación, confirme que las células fluorescentes en la capa molecular del giro dentado o DG a una profundidad de 500 micrómetros desde el fondo del vidrio se visualizan en todo el campo de visión.
Solo en caso de una cirugía exitosa, las señales DG se pueden detectar inmediatamente. Elevar el ratón postoperatorio en una carcasa individual durante varias semanas. Coloque el ratón anestesiado bajo el microscopio de dos fotones.
Realizar las imágenes del hipocampo. Confirmar si la calidad y la intensidad de las imágenes captadas tras la reducción del edema postoperatorio son mejores o comparables a las captadas el día de la cirugía. Asegúrese de que la microglía ha recuperado su morfología ramificada.
A continuación, realice imágenes in vivo en la capa de interés en el CA1. La microglía en ratones CX3CR1-GFP capturados inmediatamente después de la cirugía no mostró una activación prominente. Después de una cirugía exitosa sin inducción de edema, las profundidades de imagen de dos fotones excedieron todas las capas de CA1 y alcanzaron los 500 micrómetros de la superficie quirúrgica.
La microglía en la fase crónica de más de tres semanas después de la cirugía exhibió una mayor intensidad y resolución fluorescente y una distribución más homogénea debido a la reducción del edema y la inflamación. La microglía en todas las capas ya restauró su morfología ramificada y exhibió cuerpos celulares inmóviles y procesos altamente modales. Las imágenes de alta resolución sobre todo el CA1 se proporcionaron durante varios meses.
Las señales de la microglía fluorescente ayudan a identificar las capas del hipocampo. La microglía en el alvéo tenía cuerpos celulares alargados y procesos que se extendían a lo largo de los tractos axonales. La microglía en el estrato piramidal podría distinguirse por la menor densidad de sus procesos.
La frontera entre el CA1 y el DG podía ser reconocida por los vasos sanguíneos gruesos que corrían a lo largo del límite, lo que se reconocía mejor etiquetando los vasos con sulforhodamine 101. Como ejemplo de aplicación, se obtuvieron imágenes simultáneas de la microglía positiva GFP y de las neuronas piramidales marcadas con tdTomato. El etiquetado neuronal ayudó a comprender las estructuras exactas de la capa del CA1.
El punto más importante es reducir el daño de la cirugía. Evite el daño tisular por aspiración. Aplique una presión suave al insertar el fondo de vidrio y evite que el cemento dental toque la superficie del cerebro.
Este enfoque ayudará a identificar el papel de la microglía en el hipocampo. Por ejemplo, cómo interactúan las microglías con las neuronas, cómo están involucradas en el aprendizaje y cómo controlan las enfermedades cerebrales.
