I ruoli della microglia nell'ippocampo non sono ancora completamente compresi. Questo protocollo può visualizzare direttamente come le microglia contattano e regolano i neuroni. L'imaging in vivo della microglia e dei neuroni a riposo nell'ippocampo è stato molto difficile.
Questo metodo può risolvere questo problema. Per impiantare la finestra di osservazione, creare un solco circolare di tre millimetri sul cranio usando un pugno dermico, assicurando l'allineamento del solco con l'area precedentemente contrassegnata. Quando il punch dermico raggiunge lo strato più interno del cranio prima di toccare la dura sottostante, sollevare delicatamente l'isola ossea centrale usando un ago calibro 30.
Quindi, rimuovere con attenzione la dura usando un raccoglitore di dura. Aspirare la pia, i vasi piali e il tessuto corticale dalla superficie. Mantenere omogenea la profondità della superficie del tessuto esposto su tutta la finestra cranica e approfondire gradualmente l'aspirazione fino a esporre le fibre della capsula esterna.
Dopo aver posizionato la punta di aspirazione sulla capsula esterna vicino al ventricolo laterale all'estremità rostrolaterale della finestra cranica, rimuovere lo strato superficiale della capsula esterna che scorre nel caudomediale verso la direzione rostrolaterale. Quindi rimuovere lo strato interno che scorre nella direzione mediolaterale. Confermare la rimozione dell'intera capsula esterna controllando la piena esposizione della superficie dell'alveo e della commissura ippocampale dorsale.
Dopo essersi assicurati che l'emorragia si sia completamente fermata, riempire il foro con soluzione salina sterile fino al livello della superficie del cranio. Quindi, inserire il tubo metallico inferiore di vetro verticalmente nel foro mentre si aspira l'acqua in eccesso che trabocca dai lati del tubo fino a quando il fondo di vetro preme leggermente contro l'alveo e appiattisce parzialmente il CA1 sottostante. Utilizzando il cemento in resina dentale, fissare la parete del tubo inserito al cranio circostante.
Posizionare il mouse nel dispositivo di tenuta della testa sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni e sullo stadio di scansione XY motorizzato. Quindi riempire lo spazio tra il fondo di vetro e la lente dell'obiettivo con acqua senza creare bolle d'aria. Regolare la messa a fuoco su CA1 con la guida della fluorescenza emessa dal parenchima cerebrale e la luce riflessa dal bordo del tubo metallico sotto illuminazione continua dal laser pulsato.
Regolare l'angolazione della testa del mouse inclinando il dispositivo di tenuta della testa in modo che il fondo di vetro sia parallelo al piano di imaging. Quindi regolare il collare di correzione dell'obiettivo per ottenere la massima risoluzione a una profondità della struttura target nel CA1. Successivamente, confermare che le cellule fluorescenti nello strato molecolare del giro dentato o DG a una profondità di 500 micrometri dal fondo di vetro siano visualizzate nell'intero campo visivo.
Solo in caso di intervento chirurgico di successo, i segnali DG possono essere rilevati immediatamente. Sollevare il topo postoperatorio in un alloggiamento individuale per diverse settimane. Impostare il mouse anestetizzato sotto il microscopio a due fotoni.
Eseguire l'imaging dell'ippocampo. Confermare se la qualità e l'intensità delle immagini catturate dopo la riduzione dell'edema postoperatorio sono migliori o paragonabili a quelle catturate il giorno dell'intervento. Assicurarsi che le microglia abbiano recuperato la loro morfologia ramificata.
Quindi eseguire l'imaging in vivo sullo strato di interesse nel CA1. La microglia nei topi CX3CR1-GFP catturati immediatamente dopo l'intervento chirurgico non ha mostrato alcuna attivazione prominente. Dopo un intervento chirurgico di successo senza induzione di edema, le profondità di imaging a due fotoni hanno superato gli interi strati CA1 e hanno raggiunto i 500 micrometri dalla superficie chirurgica.
La microglia nella fase cronica di più di tre settimane dopo l'intervento chirurgico ha mostrato maggiore intensità e risoluzione fluorescente e una distribuzione più omogenea a causa della riduzione dell'edema e dell'infiammazione. Le microglia in tutti gli strati hanno già ripristinato la loro morfologia ramificata e hanno mostrato corpi cellulari immobili e processi altamente modali. Le immagini ad alta risoluzione sull'intero CA1 sono state fornite per diversi mesi.
I segnali provenienti dalla microglia fluorescente aiutano a identificare gli strati ippocampali. La microglia nell'alveo aveva corpi cellulari allungati e processi che si estendevano lungo i tratti assonali. Le microglia nello strato pyramidale potrebbero essere distinte dalla minore densità dei loro processi.
Il confine tra il CA1 e il DG potrebbe essere riconosciuto da spessi vasi sanguigni che corrono lungo il confine che è stato meglio riconosciuto etichettando i vasi con sulforhodamine 101. Come esempio di applicazione, sono state visualizzate simultaneamente microglia positive alla GFP e neuroni piramidali marcati con tdTomato. La marcatura neuronale ha aiutato a comprendere le esatte strutture degli strati del CA1.
Il punto più importante è ridurre i danni chirurgici. Evitare danni ai tessuti per aspirazione. Applicare una leggera pressione quando si inserisce il fondo di vetro ed evitare che il cemento dentale tocchi la superficie del cervello.
Questo approccio aiuterà a identificare il ruolo della microglia nell'ippocampo. Ad esempio, come le microglia interagiscono con i neuroni, come sono coinvolti nell'apprendimento e come controllano le malattie del cervello.
