해마에서 미세 아교 세포의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 프로토콜은 미세아교세포가 뉴런과 접촉하고 조절하는 방법을 직접 이미지화할 수 있습니다. 해마에서 쉬고 있는 미세아교세포와 뉴런의 생체 내 이미징은 매우 어려웠습니다.
이 방법으로이 문제를 해결할 수 있습니다. 관찰 창을 이식하려면 피부 펀치를 사용하여 두개골에 3 밀리미터 원형 홈을 만들어 홈이 이전에 표시된 영역과 정렬되도록합니다. 피부 펀치가 밑에 있는 경막에 닿기 전에 두개골의 가장 안쪽 층에 도달하면 30게이지 바늘을 사용하여 중앙 뼈 섬을 부드럽게 들어 올립니다.
그런 다음 경막 피커를 사용하여 경막을 조심스럽게 제거합니다. 표면에서 pia, pial 혈관 및 피질 조직을 흡인합니다. 노출된 조직 표면의 깊이를 전체 두개골 창에 걸쳐 균일하게 유지하고 외부 캡슐의 섬유가 노출될 때까지 점차적으로 흡인을 깊게 합니다.
흡입 팁을 두개골 창의 외측 끝에서 외측 심실 근처의 외부 캡슐에 배치한 후 꼬리 내측에서 외측 방향으로 달리는 외부 캡슐의 표면층을 제거합니다. 그런 다음 내측 방향으로 실행되는 내부 레이어를 제거합니다. 폐포 표면의 전체 노출과 등쪽 해마 교합을 확인하여 전체 외부 캡슐의 제거를 확인하십시오.
출혈이 완전히 멈췄는지 확인한 후 두개골 표면의 높이까지 멸균 식염수로 구멍을 채 웁니다. 그런 다음 유리 바닥이 폐포를 가볍게 누르고 밑에 있는 CA1을 부분적으로 평평하게 할 때까지 튜브 측면에서 넘쳐흐르는 과도한 물을 흡입하면서 유리 바닥 금속 튜브를 구멍에 수직으로 삽입합니다. 치과용 레진 시멘트를 사용하여 삽입된 튜브의 벽을 주변 두개골에 고정합니다.
마우스를 이광자 현미경의 대물 렌즈 아래 헤드 고정 장치에 놓고 전동 XY 스캐닝 s에 놓습니다.tage. 그런 다음 기포를 생성하지 않고 유리 바닥과 대물 렌즈 사이의 공간을 물로 채웁니다. 펄스 레이저에 의한 지속적인 조명 하에서 뇌 실질에서 방출되는 형광과 금속 튜브 가장자리에서 반사된 빛의 안내로 초점을 CA1로 조정합니다.
유리 바닥이 이미징 평면과 평행이 되도록 헤드 고정 장치를 기울여 마우스 헤드의 각도를 조정합니다. 그런 다음 대물렌즈의 보정환을 조정하여 CA1의 대상 구조 깊이에서 가장 높은 해상도를 얻습니다. 다음으로, 유리 바닥으로부터 500 마이크로미터 깊이에 있는 치아이랑 또는 DG의 분자층에 있는 형광 세포가 전체 시야에서 이미지화되어 있는지 확인한다.
수술이 성공한 경우에만 DG 신호를 즉시 감지할 수 있습니다. 몇 주 동안 개별 하우징에서 수술 후 마우스를 들어 올립니다. 마취된 마우스를 이광자 현미경으로 설정합니다.
해마의 이미징을 수행하십시오. 수술 후 부종 감소 후 촬영한 영상의 품질과 강도가 수술 당일 촬영한 영상과 비슷하거나 비슷한지 확인합니다. 미세아교세포가 파급된 형태를 회복했는지 확인하십시오.
그런 다음 CA1의 관심 레이어에 대한 생체 내 이미징을 수행합니다. 수술 직후 포획된 CX3CR1-GFP 마우스의 미세아교세포는 눈에 띄는 활성화를 나타내지 않았습니다. 부종 유도 없이 성공적인 수술 후, 이광자 이미징 깊이는 전체 CA1 층을 초과하고 수술 표면에서 500마이크로미터에 도달했습니다.
수술 후 3주 이상의 만성기의 미세아교세포는 부종과 염증 감소로 인해 더 높은 형광 강도와 분해능 및 더 균질한 분포를 나타냈습니다. 모든 층의 미세아교세포는 이미 파급된 형태를 복원하고 움직이지 않는 세포체와 고도의 모달 과정을 나타냈습니다. 전체 CA1에 대한 고해상도 이미지는 몇 달 동안 제공되었습니다.
형광 미세아교세포의 신호는 해마층을 식별하는 데 도움이 됩니다. alveus의 Microglia는 축삭 관을 따라 뻗어있는 길쭉한 세포체와 과정을 가졌습니다. 피라미드 지층의 미세 아교 세포는 공정의 밀도가 낮기 때문에 구별 될 수 있습니다.
CA1과 DG 사이의 경계는 경계를 따라 흐르는 두꺼운 혈관에 의해 인식될 수 있으며, 이는 설포로다민 101로 혈관을 표시함으로써 더 잘 인식되었습니다. 적용 예로, GFP 양성 미세아교세포와 tdTomato 표지된 피라미드 뉴런을 동시에 이미지화했습니다. 뉴런 라벨링은 CA1의 정확한 층 구조를 이해하는 데 도움이 되었습니다.
가장 중요한 점은 수술 손상을 줄이는 것입니다. 흡인에 의한 조직 손상을 피하십시오. 유리 바닥을 삽입할 때 부드러운 압력을 가하고 치과용 시멘트가 뇌 표면에 닿지 않도록 합니다.
이 접근법은 해마에서 미세아교세포의 역할을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 미세아교세포가 뉴런과 어떻게 상호 작용하는지, 뉴런이 학습에 어떻게 관여하는지, 뇌 질환을 어떻게 제어하는지.
