Mikroglia'nın hipokampustaki rolleri henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Bu protokol, mikroglia'nın nöronlarla nasıl temas ettiğini ve düzenlediğini doğrudan görüntüleyebilir. Hipokampustaki istirahat mikroglia ve nöronların in vivo görüntülenmesi çok zor olmuştur.
Bu yöntem bu sorunu çözebilir. Gözlem penceresini implante etmek için, bir dermal zımba kullanarak kafatası üzerinde üç milimetrelik dairesel bir oluk açın ve oluğun önceden işaretlenmiş alanla hizalanmasını sağlayın. Dermal yumruk, altta yatan duraya dokunmadan önce kafatasının en iç tabakasına ulaştığında, 30 gauge'lik bir iğne kullanarak merkezi kemik adasını yavaşça kaldırın.
Ardından, bir dura seçici kullanarak dura'yı dikkatlice çıkarın. Pia, pial damarları ve kortikal dokuyu yüzeyden aspire edin. Maruz kalan doku yüzeyinin derinliğini tüm kraniyal pencere boyunca homojen tutun ve dış kapsülün lifleri açığa çıkana kadar aspirasyonu kademeli olarak derinleştirin.
Emme ucunu kraniyal pencerenin rostrolateral ucundaki lateral ventrikülün yakınındaki dış kapsüle yerleştirdikten sonra, kaudomedialde çalışan dış kapsülün yüzey tabakasını rostrolateral yöne doğru çıkarın. Daha sonra mediolateral yönde çalışan iç tabakayı çıkarın. Alveus yüzeyinin ve dorsal hipokampal komissurenin tam olarak maruz kalmasını kontrol ederek tüm dış kapsülün çıkarılmasını onaylayın.
Kanamanın tamamen durduğundan emin olduktan sonra, deliği kafatası yüzeyinin seviyesine kadar steril salinle doldurun. Daha sonra, cam taban metal tüpü dikey olarak deliğe yerleştirin ve cam taban alveusa hafifçe bastırana ve altta yatan CA1'i kısmen düzleştirene kadar tüpün kenarlarından taşan fazla suyu aspire edin. Diş reçine çimentosunu kullanarak, yerleştirilen tüpün duvarını çevreleyen kafatasına sabitleyin.
Fareyi kafa tutma cihazına, iki foton mikroskobunun objektif merceğinin altına ve motorlu XY tarama aşamasına yerleştirin. Ardından, cam taban ile objektif lens arasındaki boşluğu hava kabarcıkları oluşturmadan suyla doldurun. Beyin parankiminden yayılan floresan ve darbeli lazer tarafından sürekli aydınlatma altında metal tüpün kenarından yansıyan ışığın rehberliğinde odağı CA1'e ayarlayın.
Kafa tutma aygıtını, cam taban görüntüleme düzlemine paralel olacak şekilde eğerek fare kafasının açısını ayarlayın. Ardından, CA1'deki hedef yapının derinliğinde en yüksek çözünürlüğü elde etmek için hedefin düzeltme tasmasını ayarlayın. Daha sonra, dentat girusun veya DG'nin moleküler tabakasındaki cam tabandan 500 mikrometre derinlikteki floresan hücrelerin tüm görüş alanında görüntülendiğini doğrulayın.
Sadece başarılı bir ameliyat durumunda, DG sinyalleri hemen tespit edilebilir. Postoperatif fareyi birkaç hafta boyunca bireysel konutta kaldırın. Anestezi uygulanan fareyi iki fotonlu mikroskop altına yerleştirin.
Hipokampusun görüntülemesini gerçekleştirin. Postoperatif ödemin azaltılmasından sonra çekilen görüntülerin kalitesinin ve yoğunluğunun ameliyat gününde yakalananlardan daha iyi veya karşılaştırılabilir olup olmadığını onaylayın. Mikroglia'nın parçalanmış morfolojilerini geri kazandığından emin olun.
Daha sonra CA1'deki ilgi katmanında in vivo görüntüleme gerçekleştirin. Ameliyattan hemen sonra yakalanan CX3CR1-GFP farelerdeki mikroglia, belirgin bir aktivasyon göstermedi. Ödem indüksiyonu olmadan yapılan başarılı ameliyattan sonra, iki fotonlu görüntüleme derinlikleri tüm CA1 katmanlarını aştı ve cerrahi yüzeyden 500 mikrometreye ulaştı.
Ameliyattan üç haftadan uzun bir süre sonra kronik fazdaki mikroglia, azalmış ödem ve inflamasyon nedeniyle daha yüksek floresan yoğunluğu ve çözünürlüğü ve daha homojen dağılım gösterdi. Tüm katmanlardaki mikroglia, parçalanmış morfolojilerini zaten restore etti ve hareketsiz hücre gövdeleri ve oldukça modal süreçler sergiledi. CA1'in tamamında yüksek çözünürlüklü görüntüler birkaç ay boyunca sağlandı.
Floresan mikrogliadan gelen sinyaller hipokampal tabakaların tanımlanmasına yardımcı olur. Alveustaki mikroglia, aksonal yollar boyunca uzanan uzatılmış hücre gövdelerine ve süreçlerine sahipti. Stratum piramidaldeki mikroglia, işlemlerinin daha düşük yoğunluğu ile ayırt edilebilir.
CA1 ve DG arasındaki sınır, sınır boyunca uzanan kalın kan damarları tarafından tanınabilir ve bu da damarların sülforhodamin 101 ile etiketlenmesiyle daha iyi tanınmıştır. Bir uygulama örneği olarak, GFP pozitif mikroglia ve tdDomates etiketli piramidal nöronlar aynı anda görüntülendi. Nöronal etiketleme, CA1'in tam katman yapılarını anlamaya yardımcı oldu.
En önemli nokta ameliyat hasarını azaltmaktır. Aspirasyonla doku hasarından kaçının. Cam tabanını yerleştirirken hafif basınç uygulayın ve diş çimentosunun beyin yüzeyine temas etmesini önleyin.
Bu yaklaşım, mikroglia'nın hipokampustaki rolünü tanımlamaya yardımcı olacaktır. Örneğin, mikroglia'nın nöronlarla nasıl etkileşime girdiği, öğrenmeye nasıl dahil oldukları ve beyin hastalıklarını nasıl kontrol ettikleri.
