ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI منح R01CA - 118916

1. استخراج الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إجراءات عزل الخلايا الجذعية الظهارية واحد يحتاج إلى تحضير سائل الإعلام المعنية والكواشف (انظر table1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم جمع الطازجة الجلد الكبار فروة الرأس البشري من إجراءات عملية شد وجه لكمة أو خزعة ، ثم في احتضان FBS DMEM / 10 ٪ / Dispase (4 ملغ / مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الحضانة لمدة 2-4 ساعة عند 37 درجة مئوية وهي فعالة أيضا. وينبغي أن تكون قطعة الجلد وأقصى عرض لها 1 سم للسماح للانزيم لاختراق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجلد إلى طبق بتري معقمة ، سحب قبالة كل الشعر من الجلد عن طريق استيعاب رمح الشعر بالقرب من سطح الجلد وسحب بقوة وسلاسة. حدد بصيلات تساقط الشعر في مرحلة التشكل استنادا تحت المجهر تشريح ، وقطع من انتفاخ المنطقة (الشكل 1A) بصيلات نقل في أنبوب 15 مل تعقيمها. ويمكن أيضا أن تستخدم بصيلات طور التنامي إذا ما خفضت العليا في 1 / 3 من جراب للحصول على بصيلات الشعر &quot;انتفاخ&quot; منطقة (1B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شظايا جريب معزولة في خليط من 0.05 ٪ التربسين - EDTA (GIBCO) وVersene (0.53 ملي EDTA 4NA ، GIBCO) (1:1) ل15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز بشكل دوري ، إضافة 4 مل + 10 DMEM FBS ٪ لوقف رد الفعل ، وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق عند 800 دورة في الدقيقة. بدلا من ذلك ، يمكن وضع قطعة من نسيج explants جريب في الثقافة دون هضم التربسين إلى خلايا بصيلات من ثقافة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بعناية (0،2-0،5 مل حفظ ~ لتجنب فقدان الخلايا) في مناجم كونكولا للنحاس ومل 1 (خلية كيراتينية المتوسطة) ، دون إعادة EGF تعليق. </li></ol> 2. الثقافة الابتدائية الخلايا الجذعية الظهارية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل زرع الخلايا الجذعية الظهارية ، mitomycin C - تعامل ينبغي إعداد 3T3 - J2 الخلايا (الخلايا المغذية) على النحو التالي. يتم استزراع خلايا 3T3 - J2 في DMEM FBS مع 10 ٪ قبل بدء العلاج. إزالة وسائل الاعلام استنبات الخلايا ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ، وعلاج الخلايا مع C mitomycin 15μg / مل في DMEM دون المصل لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. إزالة mitomycin C المحتوية DMEM ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ، أن الخلايا جاهزة للاستخدام. (C - Mitomycin المعالجة يمكن أيضا 3T3 - J2 الخلايا تكون معدة مسبقا وتخزينها على -80 درجة مئوية ذوبان والبذور الخلايا الأولية قبل يوم واحد زراعة الخلايا الجذعية الظهارية ، احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. 150،000-200،000 ينصح 3T3 - J2 الخلايا لكل بئر من لوحة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور جراب الشعرة الخلايا الجذعية المعزولة من الخطوة 1.5 على mitomycin C - تعامل 3T3 - J2 الخلايا في مناجم كونكولا للنحاس بين عشية وضحاها دون EGF عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، وتغيير لEGF التي تحتوي على مناجم كونكولا للنحاس في اليوم التالي. تزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب تحتوي على 5 ٪ CO 2. ويتم تغذية الخلايا القرنية مع كل مناجم كونكولا للنحاس تحتوي EGF كل يوم (2) ونمت عن 14-20 يوما. فحص الخلايا كل يوم تحت المجهر. والخلايا الجذعية بصيلات الشعر شكل مستعمرات (الشكل 2A). سوف explants بصيلات الشعر شكل الامتداد بعد 10-14 يوما (الشكل 2B). </li></ol> 3. الخلايا الجذعية الظهارية مرور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحد. إزالة الخلايا المغذية 3T3 - J2 من العلاج (قبل استعد لRT) Versene. احتضان الثقافة وزعته في Versene لمدة 5 دقائق ، ثم يهز بلطف ونضح خارج الخلايا المغذية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا الجذعية بصيلات الشعر إما مع أو Versene PBS وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة استعد مسبقا (إلى 37 درجة مئوية ، الحرجة) التربسين - EDTA (2X) ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق أو أكثر إذا لزم الأمر لبصيلات الشعر الخلايا الجذعية لفصل. لم يعد من 15 دقيقة هي الأفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مناجم كونكولا للنحاس ث / س EGF لوقف التربسين ، ماصة بلطف صعودا ونزولا لتفريق الخلايا ، وتدور في أسفل 200G ، 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الخلايا مع مناجم كونكولا للنحاس من دون إحصاء ، وإعادة لوحة EGF - C على معاملة mitomycin طبقة خلايا 3T3 - J2. </li></ol> 4. خلد الخلايا الجذعية الظهارية الخلايا الأولية ، والخلايا الجذعية للبالغين حتى تصل إلى الشيخوخة بعد مرور أشهر في المسلسل والثقافة. تخليد الخلايا الجذعية الأساسي هو وسيلة فعالة لتخفيف هذه المشكلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الأولية الخلايا الجذعية الظهارية (~ 350000 خلية / 6 وحة جيدا أيضا) في ممر 1 على طبقة المغذية (3T3 - J2) والثقافة لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة PA317 LXSN خط الخلية 16E6E7 بعد يوم واحد زرع الخلايا الجذعية الأولية الظهارية مع DMEM تحتوي على 10 ٪ FBS. (هذا الخط ينتج LXSN16E6E7 الارتجاعي amphotropic التي بترميز HPV16 E6 E7 وفتح إطارات القراءة ، والتي يمكن استخدامها لنقل العدوى ستابلي وخلد العديد من أنواع الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج PA317 LXSN خط الخلية 16E6E7 مع C mitomycin لمدة 2 ساعة (البروتوكول نفسه مع خلايا 3T3 - J2). إضافة mitomycin C تعامل PA317 LXSN 16E6E7 خط الخلية إلى الخلايا الجذعية الظهارية الابتدائي ، وشارك في الثقافة لمدة 6 أيام في مناجم كونكولا للنحاس مع EGF. تجديد مناجم كونكولا للنحاس جديدة مع وسائل الاعلام كل يوم 2 EGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 3T3 - J2 وPA317 LXSN 16E6E7 زنزانة مع Versene. إضافة mitomycin - C تعامل الخلايا NHP 3T3 - J2 (النيوميسين ، هيغروميسين ، بوروميسين مقاومة ، ~ 200000 خلايا لكل بئر) إلى الخلايا الجذعية الظهارية. ويتم اختيار الخلايا تحت 0.2 ملغ / مل من G418 (Gibco) لإضافةitional 6 أيام. تجديد الطازجة التي تحتوي على مناجم كونكولا للنحاس G418 EGF مع وسائل الاعلام كل يوم 2. وسيتم قيد الحياة خلدت الخلايا الجذعية الخلايا الجذعية الظهارية. وينبغي وضع جيد من التعليم الابتدائي الخلايا الجذعية الظهارية التي لا تشارك في تربيتها مع PA317 الخلية 16E6E7 LXSN كعنصر تحكم لاختيار G418 ، يجب قتل جميع الخلايا في هذه البئر التي G418 بعد 6 أيام من التحديد. </li></ol> 5. ممثل النتائج مرور وقت مبكر من خلايا الجلد الجذعية الظهارية وخلدت الخلايا الجذعية الظهارية شكل مستعمرات ضيقة تتكون من الخلايا القرنية الصغيرة (الشكل 2A) محاطة الخلايا المغذية. إذا كان المثقف في وسائل الاعلام الحرة في المصل مع ملاحق محددة ، من دون طبقة وحدة التغذية ، فإن الخلايا الجذعية لا تفريق وشكل مستعمرات ضيقة (كما أنها تنمو الخلايا واحد ومجموعات صغيرة). خلدت الخلايا الجذعية الظهارية الحفاظ على النمط الظاهري مستقرة لمدة 12 شهرا&gt; للمرور مستمرة ، ولكن تميل إلى شكل أكثر إحكاما من مستعمرات الخلايا الأولية. وهم لا يشكلون المستعمرات مرسى مستقلة في المقايسات آغار ميسرة ، مشيرا إلى أن هذه الخلايا خلد لا تملك خصائص الخلايا السرطانية. في المرحلتين الابتدائية وخلدت الخلايا الجذعية الظهارية الشعر تعبير عن الخلايا الجذعية علامة جريب cytokeratin 15 (الشكل 3A) ، وقادرة على التمايز إلى البشرة بصيلات الشعر ، والأنساب الزهمية (الشكل 3B - D). <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> التقطه الشكل 1. الشعر. بعد نتف من dispase معاملة الجلد وبصيلات الشعر تظهر إما نادي الشعر تساقط الشعر (A) مع كرة من الخلايا المحيطة الجزء السفلي من الشعر ، أو الشعر طور التنامي (B) مع الأكمام من ظهارة المحيطة طول الشعر. انتفاخ في منطقة الطور الانتهائي أشكال منطقة متميزة المورفولوجي لتشريح الدقيقة ، في حين أن انتفاخ طور التنامي أقل مميزة. لمبة طور التنامي يحتوي الكيراتينية مصفوفة ، تمثل العبور تضخيم الخلايا التي يمكن أيضا أن تكون معزولة والمثقفين. <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. خلايا الجذعية الثقافات. (أ) الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد شكل مستعمرات الظهارية ضيقة (تسميهم E) عند تربيتها في مناجم كونكولا للنحاس مع طبقة من الخلايا المغذية (تسميهم F). (ب) explants بصيلات الشعر تؤدي إلى الامتداد الظهارية. ويرد في المنطقة انتفاخ تساقط الشعر (الذين تسميهم تي) إلى صحن وتحيط الخلية الظهارية مستعمرة مع الخلايا المغذية. <img src="/files/ftp_upload/2561/2561fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تمايز الخلايا الجذعية. (أ) الحفاظ على مستعمرات الخلايا الجذعية من علامات التعبير الظهارية مثل cytokeratin 15. (ب) يمكن أن تكون متمايزة خلايا الجلد الجذعية الظهارية على طول الشعر المسام النسب على النحو الذي يحدده K6Hf التعبير. يمكن (C) تكون هذه الخلايا المستزرعة في دي epidermalized الأدمة أو المصفوفات الأخرى في واجهة الهواء السائل ، وسوف تشكل طبقات مع طبقة البشرة متقرن ، الطبقة الحبيبية والطبقة الشائكة. يمكن (D) تكون الخلايا الجذعية المستحثة على طول نسب الزهمية مع الكريات الحمراء النفط إيجابية.

<ol>
	<li>Jones, P. H., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+human+epidermal+stem+cells+from+transit+amplifying+cells+on+the+basis+of+differences+in+integrin+function+and+expression.">Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression.</a> Cell. 73, 713-724 (1993).</li><li>Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C8/144B+monoclonal+antibody+recognizes+cytokeratin+15+and+defines+the+location+of+human+hair+follicle+stem+cells.">The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).</li><li>Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+the+intestinal+stem+cell+as+a+paradigm.">Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm.</a> Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).</li><li>Slac, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+epithelial+tissues.">Stem cells in epithelial tissues.</a> Science. 287, 1431-1433 (2000).</li><li>It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+hair+follicle+bulge+contribute+to+wound+repair+but+not+to+homeostasis+of+the+epidermis.">Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis.</a> Nat Med. 11, 1351-134 (2005).</li><li>Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+find+their+niche.">Stem cells find their niche.</a> Nature. 414, 98-104 (2001).</li><li>Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+follicular+stem+cells+in+forming+not+only+the+follicle+but+also+the+epidermis.">Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis.</a> Cell. 102, 451-461 (2000).</li><li>Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+renewal+of+hair+follicles+from+adult+multipotent+stem+cells.">Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells.</a> Cell. 104, 233-245 (2001).</li><li>Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotsarelis+G+Capturing+and+profiling+adult+hair+follicle+stem+cells.">Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).</li><li>Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-potentiality+of+a+new+immortalized+epithelial+stem+cell+line+derived+from+human+hair+follicles.">Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles.</a> In vitro Cell. &#38; Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).</li><li>Ohyama, M., Vogel, J. C. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=delivery+to+the+hair+follicle.">delivery to the hair follicle.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 8, 204-206 (2003).</li><li>Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+follicle+stem+cell-targeted+gene+transfer+and+reconstitution+system.">Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system.</a> Gene Ther. 13, 732-737 (2006).</li><li>Stenn, K. S., Cotsarelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+the+hair+follicle:+fringe+benefits+of+stem+cell+technology.">Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology.</a> Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).</li><li>Hoeller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+and+rapid+method+to+construct+skin+equivalents+from+human+hair+follicles+and+fibroblasts.+Exp+Dermatol+10.">An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10.</a> , 264-271 (2001).</li><li>Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reepithelialization+of+a+full-thickness+burn+from+stem+cells+of+hair+follicles+micrografted+into+a+tissue-engineered+dermal+template+(Integra).">Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra).</a> Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).</li><li>Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li><li>Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hair+growth+deficiency+is+linked+to+a+genetic+defect+in+the+phospholipase+gene+LIPH.">Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH.</a> Science. 314, 982-985 (2006).</li><li>Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+epidermolysis+bullosa+by+transfer+of+wild-type+bone+marrow+cells.">Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells.</a> Blood. 113, 1167-1174 (2009).</li><li>Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+transplantation+for+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa.">Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).</li><li>Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Correction+of+Type+VII+Collagen+Expression+in+Dystrophic+Epidermolysis+Bullosa.">Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa.</a> J Invest Dermatol. , (2010).</li><li>Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+with+neural+crest+characteristics+derived+from+the+bulge+region+of+cultured+human+hair+follicles.">Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).</li><li>Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+hair+graying:+incomplete+melanocyte+stem+cell+maintenance+in+the+niche.">Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche.</a> Science. 307, 720-724 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخلية استخراج والثقافة الأساليب المذكورة هي سهلة وقابلة للتكرار من المستغرب. لقد ولدت لنا الثقافات طلائي الخلايا الجذعية من عشرات من الأفراد عبر طائفة واسعة العمرية ، بما في ذلك المرضى الذين يعانون من عيوب البشرة ورثت 18. فمن الأفضل أن تبدأ العملية في يوم الحص?...

خلية كيراتينية سائل الإعلام (مناجم كونكولا للنحاس) [DMEM ولحم الخنزير ليالي F12 (GIBCO ، 3:1) ، الأدينين (سيغما ، 180 ملم) ، و 10 ٪ الجنين مصل الأبقار (GIBCO) والكوليرا توكسين (ICN ، 0.1 نانومتر) ، البنسلين / الستربتوميسين (GIBCO ، 100 U / مل و 100 ملغم / لتر ، على التوالي) ، هيدروكورتيزون (سيغما ، 0.4 ملغ / مل ، و 1.1 ملم) ، T/T3 (ترانسفيرين ، GIBCO ، 5 ميكروغرام / مل ، 649 نانومتر ؛ وtriiodo - L ثيرونين ، سيغما ، 2 نانومتر) والأنسولين (سيغما ، 5 ملغ / مل و 862 نانومتر) ، وEGF (سيغما ، 10 نانوغرام / مل و 1.6 نانومتر) ، ودرجة الحموضة 7.2]

isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin

والتوازن لجميع الأنسجة ذاتي يعتمد على تجديد الخلايا الجذعية للبالغين. والخلايا الجذعية غير المتمايزة الخضوع الانقسامات غير المتماثلة ، وأنها تولد الخلايا الوليدة التي تحتفظ النمط الظاهري الخلايا الجذعية والعبور تضخيم الخلايا (خلايا TA) التي تهاجر من جذع الخلية المتخصصة ، والخضوع الانتشار السريع والتفريق الميئوس من اعد اسكان الأنسجة. تم التعرف على الخلايا الجذعية الظهارية في البشرة ، بصيلات الشعر ، والأمعاء والخلايا مع ارتفاع محتمل في المختبر والتكاثري وبطيئة الدراجات التسمية الاحتفاظ الخلايا في الجسم الحي 1-3. الكبار ، وأنسجة الخلايا الجذعية الخاصة هي المسؤولة عن تجديد الأنسجة التي يقيمون فيها أثناء دوران فيزيولوجية طبيعية ، وكذلك اثناء اوقات التوتر 4-5. علاوة على ذلك ، تعتبر عموما لتكون الخلايا الجذعية متعددة قوية ، تمتلك القدرة على أن تؤدي إلى أنواع خلايا متعددة داخل النسيج 6. على سبيل المثال ، يمكن للخلايا الجذعية القوارض جريب الشعرة توليد البشرة والغدد الدهنية وبصيلات الشعر 7-9. لقد أظهرنا أن الخلايا الجذعية من منطقة جريب شعرة الإنسان انتفاخ يحمل امكانيات متعددة 10. أصبحت الخلايا الجذعية أداة قيمة في مجال البحوث الطبية الحيوية ، ونظرا لفائدتها في النظام باعتباره المختبر لدراسة البيولوجيا التطورية ، والتمايز ، وتكون الأورام لفائدتها العلاجية الممكنة. فمن المرجح أن الكبار الخلايا الجذعية الظهارية مفيدا في علاج أمراض مثل خلل التنسج الأدمة ، monilethrix ، متلازمة Netherton والمرض مينكيس ، وانحلال البشرة الفقاعي الوراثي alopecias 11-13. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مشاكل الجلد الأخرى مثل حروق والجروح والقروح المزمنة الاستفادة من الخلايا الجذعية المتعلقة العلاجات 14،15. نظرا لإمكانية إعادة برمجة خلايا بالغة الى دولة ذات قوة تناسلية متعددة (خلايا الجذع) 16،17 ، قد الجذعية البالغة في متناول الجميع وتوسيع الخلايا في الجلد البشري توفر مصدرا قيما للخلايا لتحريض المصب والعلاج لمجموعة واسعة من الأمراض بما في ذلك مرض السكري ومرض باركنسون.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

ووصف سريع ، طريقة سليمة قابلة للاستمرار في عزل الخلايا الجذعية البالغة الظهارية من الجلد البشري. الأسلوب يستخدم الهضم الأنزيمي مصفوفة الكولاجين الجلد ، تليها نتف من بصيلات الشعر وعزلة تعليق خلية واحدة أو شظايا الأنسجة للثقافة الخلية.

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

isolation-and-culture-of-adult-epithelial-stem-cells-from-human-skin

Research

JoVE Journal

Biology

28.2K Views.  University of Massachusetts Medical School. ووصف سريع ، طريقة سليمة قابلة للاستمرار في عزل الخلايا الجذعية البالغة الظهارية من الجلد البشري. الأسلوب يستخدم الهضم الأنزيمي مصفوفة الكولاجين الجلد ، تليها نتف من بصيلات الشعر وعزلة تعليق خلية واحدة أو شظايا الأنسجة للثقافة الخلية.

Video: Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

العزلة والثقافة، وزرع خلايا العضلات الأقمار الصناعية

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...