تجعل الطبيعة المعقدة للمركبات الكهربائية من الصعب التعرف على السكان الفرعيين محل الاهتمام ، ويمكن لهذا البروتوكول اكتشافها من خلال نمطها الظاهري وملف تعريف الحجم والخصائص الميكانيكية النانوية. هذا المزيج من التقنية هو طريقة خالية من الملصقات ، والتي تسمح لنا باكتشاف المركبات الكهربائية في الوقت الفعلي من وسائط الحالة وبلازما الدم. تمكن هذه التقنية من توصيف مجموعة فرعية عميقة من الجسيمات النانوية ذات الأهمية ، من أجل استخدامها كمؤشرات حيوية لعلم الأمراض ، أو تستخدم أيضا كجسيمات نانوية لتوصيل الدواء.
نظرا لأنها طريقة حساسة للغاية ، فمن الضروري الانتباه إلى إعداد الرقائق الحيوية قبل حقن عينتك التي تهمك. بعد طلاء الرقائق وتشغيلها ، احتضان الرقاقة الحيوية في خليط من 200 مليمولار إيثيل ثنائي ميثيل أمينوبروبيل كربوديميد / N-hydroxysuccinimide و 50 مليمولار لكل لتر N-hydroxysuccinimide لمدة 30 دقيقة على الأقل في الظلام في درجة حرارة الغرفة. باستخدام المراقب ، أضف 300 نانولتر من محلول ليجند واحتضان الرقاقة الحيوية تحت حمام صوتي لمدة 30 دقيقة.
اغسل الرقاقة الحيوية من الأعلى بماء عالي النقاء. أضف قطرة من الزيت بنفس معامل الانكسار مثل المنشور لإنشاء طبقة رقيقة موحدة بين الرقاقة الحيوية والمنشور ، وضعها برفق على منشور بنفس معامل الانكسار مثل الرقاقة الحيوية. لتصوير رنين البلازمون السطحي ، قم بتركيب الرقاقة الحيوية على نظام SPRi.
انتقل إلى القائمة المنسدلة على الجانب الأيسر من البرنامج ، وانقر فوق دليل العمل. ابحث عن الصورة التي تظهر فيها نقاط مختلفة ، وانقر لتحديد هذه الصورة. ثم اكتب اسم عائلات ligand ، وانقر على تعريف الأنواع Finish.
اسحب الخط الأسود مع المؤشر إلى زاوية العمل المثلى. انقر فوق تحريك المرآة إلى زاوية العمل ، وحدد زاوية العمل. انقر الآن على الحركية.
نظرا لأن البرنامج يطالب المستخدم بتحديد عنصر التحكم السلبي ، فاختر لا يوجد تحكم سلبي في هذه المرحلة. حقن ألبومين مصل الفئران بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة لمدة أربع دقائق. حقن الإيثانولامين بمعدل 20 ميكرولترا في الدقيقة لمدة 10 دقائق لإلغاء تنشيط المجموعات الكربوكسيلية التي لا تزال موجودة ومتفاعلة على السطح.
بعد ذلك ، اغسل الرقاقة الحيوية عن طريق حقن 40 مليمول OG بمعدل 50 ميكرولتر في الدقيقة لمدة أربع دقائق. حقن الحويصلات خارج الخلية بتركيز محدد على الرقاقة الوظيفية الحيوية مع اتباع حركية تفاعل الحويصلات على البقع المختلفة ، في وقت واحد. حدد أيضا قيمة الانعكاس ومستوى التفاعل.
بمجرد الاستقرار ، قم بحقن الجلوتارالدهيد على الشريحة لإصلاح الحويصلات خارج الخلية في مكانها قبل إجراء تصوير AFM. قم بمحاذاة الرقاقة الحيوية أعلى القناع على الشريحة الزجاجية. استخدم كاميرا CCD أعلى AFM لتحديد موقع الكابولي في المكان الصحيح الذي يجب مسحه ضوئيا.
ابدأ اكتساب AFM في وضع الاتصال من ثلاث إلى خمس مناطق كبيرة إلى صغيرة. بعد ذلك ، تعامل مع صور AFM باستخدام برنامج معالجة بيانات JPK عن طريق تحديد قناة الارتفاع أولا. اختر ملاءمة كثيرة الحدود ليتم طرحها من كل سطر للحصول على خطوط مسح مستقيمة.
حدد عتبة الارتفاع على حبيبات الذهب للتخلص من الخشونة على السطح. تحدد وحدة استخراج الحبوب الحبوب باستخدام عتبة ارتفاع تبلغ 8.5 نانومتر. تم تحليل الرقائق الحيوية المتعددة بعد تخميل الألبومين.
الشريحة بدون افتراضي. الرقاقة مع بعض العيوب ، بسبب انصهار البقع ، أو ضعف التطعيم ، أو الفقاعات أو الملوثات. وتظهر شريحة ذهبية عارية بدون مصفوفات دقيقة لفحص امتزاز الحويصلات خارج الخلية على الذهب.
أظهرت تجربة الالتقاط على رقاقة حيوية متعددة الإرسال إشارات انعكاسية جيدة للروابط المختلفة ، ونسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة للروابط المختلفة ، لأن استجابة التحكم السلبي كانت ضئيلة. أظهر امتزاز الحويصلة خارج الخلية بعد حقن عينة الحويصلة خارج الخلية إشارة انعكاسية عالية ، مما يشير إلى أن تلك الحويصلات كانت قادرة على الامتصاص والبقاء مستقرة على رقاقة الذهب. بعد تحميل الحويصلة خارج الخلية ، تم إنشاء صور AFM واسعة النطاق وصغيرة الحجم للحويصلات خارج الخلية على الرقائق الحيوية.
تتيح الرؤية الأقرب عالية الدقة قياس الحويصلات خارج الخلية. تراوح القطر الفعال للحويصلات خارج الخلية على رقاقة حيوية من 30 إلى 300 نانومتر ، مع أغلبية كبيرة حوالي 60 نانومتر. كانت النتائج التي تم الحصول عليها في الهواء والسائل قابلة للمقارنة.
كشف طيف رامان من الحويصلات خارج الخلية الممتصة على شريحة عارية عن طيف واضح ، مع قمم تتوافق بشكل أساسي مع اهتزازات الميثيلين ، والتي ترتبط بدهون أغشية الحويصلة خارج الخلية. من المهم تحضير رقاقة حيوية بدقة حتى تتمكن من اكتشاف المركبات الكهربائية الخاصة بك بدقة وبطريقة قابلة للتكرار. يمكن استخدام الطرق التقليدية مثل النشاف الغربي وتحليل تتبع الجسيمات النانوية لربط وتأكيد الأنماط الظاهرية وأنماط الحجم.
علاوة على ذلك ، من المتصور أن تتعمق التحليلات متعددة الأوميك في التوصيف الجزيئي للمركبات الكهربائية والتمييز المحتمل بين المجموعات الفرعية.
