Сложная природа электромобилей затрудняет распознавание интересующей субпопуляции, и этот протокол может обнаруживать их по фенотипу, размерному профилю и наномеханическим свойствам. Эта комбинация методов представляет собой метод без меток, который позволяет нам обнаруживать EV в режиме реального времени из среды состояния и плазмы крови. Этот метод позволяет охарактеризовать глубоко подмножество наночастиц, представляющих интерес, для использования в качестве биоиндикаторов патологии или также в качестве наночастиц для доставки лекарств.
Поскольку это очень чувствительный метод, крайне важно обратить внимание на препарат биочипа, прежде чем вводить интересующий вас образец. После покрытия и функционализации чипов биочип инкубируют в смеси 200-миллимолярного этилдиметиламинопропилкарбодиимида/N-гидроксисукцинимида и 50 миллимоляров на литр N-гидроксисукцинимида в течение не менее 30 минут в темноте при комнатной температуре. С помощью споттера добавьте 300 нанолитров раствора лиганда и инкубируйте биочип под звуковой ванной в течение 30 минут.
Промойте биочип сверху сверхчистой водой. Добавьте каплю масла с тем же показателем преломления, что и призма, чтобы создать однородный тонкий слой между биочипом и призмой, и аккуратно поместите ее на призму с тем же показателем преломления, что и биочип. Для поверхностной плазмонно-резонансной томографии установите биочип на систему SPRi.
Перейдите в раскрывающееся меню в левой части программного обеспечения и нажмите «Рабочий каталог». Найдите изображение, на котором видны разные пятна, и нажмите, чтобы выбрать это изображение. Затем напишите название семейств лигандов и нажмите на определение вида Finish.
Перетащите черную линию курсором на оптимальный рабочий угол. Нажмите «Переместить зеркало на рабочий угол» и выберите рабочий угол. Теперь нажмите на Кинетику.
Когда программное обеспечение предложит пользователю определить отрицательный элемент управления, выберите «Без отрицательного элемента управления» на этом этапе. Вводите сывороточный альбумин крысы со скоростью 50 микролитров в минуту в течение четырех минут. Вводите этаноламин со скоростью 20 микролитров в минуту в течение 10 минут, чтобы дезактивировать карбоксильные группы, все еще присутствующие и реагирующие на поверхности.
После этого промойте биочип, вводя 40 миллимолярных OG со скоростью 50 микролитров в минуту в течение четырех минут. Вводят внеклеточные везикулы в определенной концентрации на биофункционализированном чипе, одновременно следя за кинетикой взаимодействия везикул в разных точках. Также определите значение отражательной способности и уровень взаимодействия.
После стабилизации введите глутаровый альдегид в чип, чтобы зафиксировать внеклеточные везикулы в том месте, где они находятся, прежде чем делать АСМ-томографию. Выровняйте биочип в верхней части маски на предметном стекле. Используйте ПЗС-камеру в верхней части АСМ, чтобы локализовать консоль в нужном месте, которое необходимо сканировать.
Запускайте сбор АСМ в контактном режиме с трех-пяти больших до малых участков. Затем обработайте изображения АСМ с помощью программного обеспечения для обработки данных JPK, сначала выбрав канал высоты. Выберите полиномиальную подгонку, которую нужно вычесть из каждой строки, чтобы получить выпрямленные линии развертки.
Выберите порог высоты на золотых зернах, чтобы устранить шероховатости на поверхности. Модуль экстракции зерна маркирует зерна с помощью порога высоты 8,5 нанометров. Мультиплексные биочипы анализировали после пассивации альбумина.
Чип без дефолта. Скол с некоторыми дефектами, обусловленными слиянием пятен, слабой прививкой, пузырьками или загрязнениями. И показан голый золотой чип без микрочипов для исследования адсорбции внеклеточных везикул на золоте.
Эксперимент по захвату на мультиплексированном биочипе показал хорошие сигналы отражательной способности для разных лигандов и хорошее отношение сигнал/шум для разных лигандов, поскольку отклик отрицательного контроля был незначительным. Адсорбция внеклеточных везикул после инъекции образца внеклеточных везикул показала высокий сигнал отражательной способности, что позволяет предположить, что эти везикулы способны адсорбироваться и оставаться стабильными на золотом чипе. После загрузки внеклеточных везикул были получены крупномасштабные и мелкомасштабные АСМ-изображения внеклеточных везикул на биочипах.
Более близкий обзор с высоким разрешением позволяет проводить метрологию внеклеточных везикул. Эффективный диаметр внеклеточных везикул на биочипе варьировался от 30 до 300 нанометров, причем подавляющее большинство составляло около 60 нанометров. Результаты, полученные на воздухе и в жидкости, были сопоставимы.
Рамановский спектр внеклеточных везикул, адсорбированных на голом чипе, выявил четкий спектр с пиками, соответствующими в основном метиленовым колебаниям, которые связаны с липидами мембран внеклеточных везикул. Важно тщательно подготовить свой биочип, чтобы иметь возможность точно и воспроизводимо обнаруживать ваши электромобили. Традиционные методы, такие как вестерн-блоттинг и анализ отслеживания наночастиц, могут быть задействованы для корреляции и подтверждения фенотипов и моделей размеров.
Кроме того, предполагается, что мультиомный анализ еще глубже углубится в молекулярную характеристику EV и потенциальную дискриминацию подмножеств.
