A natureza complexa dos EVs dificulta o reconhecimento da subpopulação de interesse, e esse protocolo pode detectá-los com seu fenótipo, perfil de tamanho e propriedades nanomecânicas. Esta combinação de técnica é um método livre de rótulos, que nos permite detectar EVs em tempo real a partir do meio da condição e do plasma sanguíneo. Esta técnica permite caracterizar profundamente o subconjunto de nanopartículas de interesse, a fim de serem utilizadas como bioindicadores de patologia, ou também utilizadas como nanopartículas para a entrega de fármacos.
Uma vez que é um método muito sensível, é imperativo prestar atenção à preparação do biochip antes de injetar sua amostra de interesse. Após o revestimento e funcionalização dos chips, incubar o biochip em uma mistura de 200 milimolares de etildimetilaminopropilcarbodiimida/N-hidroxisuccinimida e 50 milimolares por litro de N-hidroxisuccinimida por pelo menos 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Usando o spotter, adicione 300 nanolitros de solução de ligante e incube o biochip sob um banho sônico por 30 minutos.
Lave o biochip de cima com água ultrapura. Adicione uma gota de óleo com o mesmo índice de refração que o prisma para criar uma camada fina uniforme entre o biochip e o prisma, e coloque-a suavemente em um prisma com o mesmo índice de refração que o biochip. Para imagens de ressonância plasmônica de superfície, monte o biochip no sistema SPRi.
Navegue até o menu suspenso no lado esquerdo do software e clique no Diretório de trabalho. Encontre a imagem onde diferentes pontos são visíveis e clique para selecionar essa imagem. Em seguida, escreva o nome das famílias de ligantes e clique na definição de espécies de acabamento.
Arraste a linha preta com o cursor para o ângulo de trabalho ideal. Clique em Mover espelho para o ângulo de trabalho e selecione um ângulo de trabalho. Agora clique em Cinética.
À medida que o software solicita que o usuário defina o controle negativo, escolha Sem controle negativo neste momento. Injete albumina sérica de rato a 50 microlitros por minuto durante quatro minutos. Injete etanolamina a 20 microlitros por minuto durante 10 minutos para desativar os grupos carboxílicos ainda presentes e reativos na superfície.
Depois, lave o biochip injetando 40 milimolares OG a 50 microlitros por minuto durante quatro minutos. Injete as vesículas extracelulares em uma concentração específica no chip biofuncionalizado enquanto segue a cinética da interação das vesículas nos diferentes pontos, simultaneamente. Determine também o valor da refletividade e o nível de interação.
Uma vez estabilizado, injete glutaraldeído no chip para fixar as vesículas extracelulares no local em que estão antes de fazer imagens de AFM. Alinhe o biochip na parte superior da máscara na lâmina de vidro. Use a câmera CCD na parte superior do AFM para localizar o cantilever no local correto que deve ser escaneado.
Inicie a aquisição do AFM no modo de contato de três a cinco áreas grandes a pequenas. Em seguida, trate as imagens AFM com o software de processamento de dados JPK selecionando primeiro o canal de altura. Escolha um ajuste polinomial a ser subtraído de cada linha para obter linhas de varredura endireitadas.
Selecione o limite de altura nos grãos de ouro para eliminar a rugosidade na superfície. O módulo de extração de grãos marca os grãos usando um limiar de altura de 8,5 nanômetros. Biochips multiplexados foram analisados após passivação de albumina.
O chip sem padrão. O chip com alguns defeitos, devido à fusão de manchas, enxerto fraco, ou bolhas ou contaminantes. E um chip de ouro nu sem microarrays para examinar a adsorção de vesículas extracelulares em ouro é mostrado.
O experimento de captura em um biochip multiplexado mostrou bons sinais de refletividade para diferentes ligantes e uma boa relação sinal-ruído para os diferentes ligantes, uma vez que a resposta do controle negativo foi insignificante. A adsorção extracelular da vesícula após a injeção da amostra de vesícula extracelular apresentou alto sinal de refletividade, sugerindo que essas vesículas foram capazes de adsorver e permanecer estáveis no chip de ouro. Após o carregamento da vesícula extracelular, foram geradas as imagens AFM em larga e pequena escala de vesículas extracelulares em biochips.
Uma visão mais próxima de alta resolução permite a metrologia de vesículas extracelulares. O diâmetro efetivo das vesículas extracelulares em um biochip variou de 30 a 300 nanômetros, com grande maioria em torno de 60 nanômetros. Os resultados obtidos em ar e líquido foram comparáveis.
O espectro Raman das vesículas extracelulares adsorvidas em um chip nu revelou um espectro claro, com picos correspondendo principalmente às vibrações de metileno, que estão associadas aos lipídios das membranas das vesículas extracelulares. É importante preparar seu biochip rigorosamente para poder detectar seus EVs com precisão e de forma reprodutível. Métodos convencionais como Western blotting e análise de rastreamento de nanopartículas podem ser utilizados para correlacionar e confirmar fenótipos e padrões de tamanho.
Além disso, as análises multi-ômicas são previstas para se aprofundar ainda mais na caracterização molecular de EV e na potencial discriminação de subconjuntos.
