האופי המורכב של כלי רכב חשמליים מקשה על זיהוי תת-האוכלוסייה המעניינת, ופרוטוקול זה יכול לזהות אותם באמצעות הפנוטיפ, פרופיל הגודל והתכונות הננו-מכניות שלהם. שילוב זה של טכניקה הוא שיטה ללא תוויות, המאפשרת לנו לזהות כלי רכב חשמליים בזמן אמת ממצב, מדיה ופלסמה בדם. טכניקה זו מאפשרת לאפיין תת-קבוצה עמוקה של ננו-חלקיקים בעלי עניין, על מנת לשמש כאינדיקטורים ביולוגיים של פתולוגיה, או לשמש גם כננו-חלקיקים לאספקת תרופות.
מכיוון שמדובר בשיטה רגישה מאוד, חובה לשים לב להכנת הביו-שבב לפני הזרקת הדגימה המעניינת אותך. לאחר ציפוי ותפקוד השבבים, יש לדגור על השבב הביולוגי בתערובת של 200 מילימולר אתיל דימתילאמינופרופיל קרבודימיד/N-הידרוקסיסוקסינימיד ו-50 מילימולר לליטר N-הידרוקסיסוקסינימיד למשך 30 דקות לפחות בחושך בטמפרטורת החדר. באמצעות הספוטר, מוסיפים 300 ננוליטר של תמיסת ליגנד ודגרים על השבב הביולוגי תחת אמבטיה קולית למשך 30 דקות.
שטפו את השבב הביולוגי מלמעלה במים טהורים במיוחד. הוסיפו טיפת שמן עם מקדם שבירה זהה לזה של המנסרה כדי ליצור שכבה דקה אחידה בין השבב למנסרה, והניחו אותה בעדינות על מנסרה עם אותו מקדם שבירה כמו השבב הביולוגי. להדמיית תהודה פלסמונית משטחית, הרכיבו את השבב הביולוגי על מערכת SPRi.
נווט לתפריט הנפתח בצד שמאל של התוכנה ולחץ על ספריית העבודה. מצאו את התמונה במקומות שבהם נקודות שונות גלויות, ולחצו לבחירת תמונה זו. לאחר מכן כתוב את שם משפחות הליגנדים, ולחץ על הגדרת המינים Finish.
גרור את הקו השחור עם הסמן לזווית העבודה האופטימלית. לחצו על 'הזז שיקוף לזווית עבודה' ובחרו זווית עבודה. עכשיו לחץ על Kinetics.
כאשר התוכנה מבקשת מהמשתמש להגדיר את הפקד השלילי, בחר ללא שליטה שלילית בשלב זה. הזריקו אלבומין בסרום חולדות בטמפרטורה של 50 מיקרוליטר לדקה למשך ארבע דקות. הזריקו אתנולמין במהירות של 20 מיקרוליטר לדקה למשך 10 דקות כדי להשבית את קבוצות הקרבוקסיליות שעדיין קיימות ומגיבות על פני השטח.
לאחר מכן, לשטוף את השבב הביולוגי על ידי הזרקת 40 מילימולר OG ב 50 מיקרוליטר לדקה במשך ארבע דקות. הזריקו את השלפוחיות החוץ תאיות בריכוז מסוים על השבב הביו-פונקציונלי תוך מעקב אחר הקינטיקה של האינטראקציה של השלפוחיות על הנקודות השונות, בו זמנית. כמו כן לקבוע את הערך של רפלקטיביות ואת רמת האינטראקציה.
לאחר הייצוב, הזריקו גלוטראלדהיד על השבב כדי לקבע בועיות חוץ-תאיות במקום שבו הן נמצאות לפני ביצוע הדמיית AFM. יישרו את השבב הביולוגי בחלק העליון של המסכה במגלשת הזכוכית. השתמש במצלמת CCD על גבי AFM כדי למקם את המזנון במקום הנכון שיש לסרוק.
התחל את רכישת AFM במצב מגע משלושה עד חמישה אזורים גדולים לקטנים. לאחר מכן, טפל בתמונות AFM באמצעות תוכנת עיבוד נתונים JPK על ידי בחירת ערוץ הגובה תחילה. בחר התאמה פולינומית שיש להחסיר מכל שורה כדי לקבל קווי סריקה מיושרים.
בחר את סף הגובה על גרגרי זהב כדי למנוע את החספוס על פני השטח. מודול מיצוי הדגנים מסמן את הגרגרים באמצעות סף גובה של 8.5 ננומטר. ביו-שבבים מרובי שבבים נותחו לאחר פסיבציה של אלבומין.
השבב ללא ברירת מחדל. השבב עם כמה פגמים, עקב היתוך של כתמים, רפטינג חלש, או בועות או מזהמים. ושבב זהב עירום ללא מיקרו-מערכים לבחינת ספיחת שלפוחיות חוץ-תאיות על זהב מוצג.
ניסוי הלכידה על שבב ביולוגי מרובה רבבים הראה אותות החזרה טובים עבור ליגנדות שונות, ויחס אות לרעש טוב עבור הליגנדות השונות, מכיוון שתגובת הבקרה השלילית הייתה זניחה. ספיחת שלפוחית חוץ-תאית לאחר הזרקת דגימת השלפוחית החוץ-תאית הציגה אות החזרה גבוה, דבר המצביע על כך ששלפוחיות אלה היו מסוגלות לספוח ולהישאר יציבות על שבב הזהב. לאחר העמסת שלפוחיות חוץ-תאיות, נוצרו תמונות AFM בקנה מידה גדול ובקנה מידה קטן של שלפוחיות חוץ-תאיות על שבבים ביולוגיים.
מבט מקרוב ברזולוציה גבוהה מאפשר מטרולוגיה של שלפוחיות חוץ-תאיות. הקוטר האפקטיבי של השלפוחיות החוץ תאיות על שבב ביולוגי נע בין 30 ל -300 ננומטר, כאשר הרוב הגדול סביב 60 ננומטר. התוצאות שהתקבלו באוויר ובנוזל היו דומות.
ספקטרום הרמאן של שלפוחיות חוץ-תאיות שנספחו על שבב עירום חשף ספקטרום ברור, עם פסגות המתאימות בעיקר לתנודות מתילן, הקשורות לשומנים של קרומי שלפוחית חוץ-תאיים. חשוב להכין את השבב הביולוגי שלכם בקפדנות על מנת שתוכלו לזהות את כלי הרכב החשמליים שלכם בצורה מדויקת וניתנת לשחזור. ניתן להשתמש בשיטות קונבנציונליות כמו ניתוח כתמים מערביים ומעקב אחר ננו-חלקיקים כדי לתאם ולאשר פנוטיפים ודפוסי גודל.
יתר על כן, ניתוחים רב-אומיים צפויים אפילו להעמיק באפיון מולקולרי של EV ובאפליה פוטנציאלית של תת-קבוצות.
