يعد تقييم سلامة القلب مكونا حاسما أثناء عملية تطوير الدواء. أثبتت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية أنها نموذج موثوق وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية. لقد أنشأنا منهجيات للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية للخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري ، والتي تعد من نمذجة الأمراض المهمة حقا ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية والطب الدقيق.
إن الدمج المتزايد للخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري في عملية تقييم السلامة القياسية قبل السريرية لديه القدرة على تحسين دقة التنبؤ بالسمية لمركبات المرشح. ابدأ بزراعة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري لمدة 10 أيام على الأقل قبل إجراء القياس. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة واضبطها على 37 درجة مئوية.
قم بتشغيل المجهر والكاميرا وإمدادات ثاني أكسيد الكربون. املأ سترة الماء الخاصة بحامل اللوحة بكمية مناسبة من الماء المعقم منزوع الأيونات. ضع صفيحة البئر 96 على حامل الصفيحة ، واحتضن الخلايا لمدة خمس دقائق على الأقل.
افتح برنامج العرض، ثم اضبط معدل إطارات الكاميرا على 75 إطارا في الثانية، ودقة الفيديو أو الصورة على 1024 × 1024 بكسل. تطبيق وظائف التركيز البؤري التلقائي والسطوع التلقائي ، وتسجيل مقاطع الفيديو والصور للخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري. ضع بعناية قطرة ثمانية ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة الخلوية الإضافية فوق منطقة قطب التسجيل لكل بئر من لوحات مصفوفة الأقطاب الدقيقة 48 للبئر.
ثم أضف ثلاثة ملليلترات من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى المنطقة المحيطة بالآبار لمنع تبخر محلول الطلاء. باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة معظم وسط المصفوفة الخلوية الإضافية من سطح البئر داخل نفس الصف أو العمود الواحد دون لمس الأقطاب الكهربائية. زرع 50،000 خلية لكل بئر في قطرة ثمانية ميكرولتر من وسط البذر فوق منطقة قطب التسجيل.
كرر ذلك حتى يتم طلاء جميع الآبار بالخلايا. ثم احتضان لوحات مصفوفة microelectrode في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة. أضف ببطء 150 ميكرولتر من وسط البذر إلى كل بئر من ألواح مصفوفة microelectrode.
في اليوم 10 بعد الطلاء ، تحقق من كثافة الضرب التلقائي للإنسان iPSC CM أحادي الطبقة تحت المجهر. ضع لوحة صفيف الأقطاب الكهربائية الدقيقة 48 جيدا في أداة التسجيل. تأكد من أن درجة الحرارة 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون 5٪افتح برنامج الملاح.
في نافذة الإعداد التجريبية، حدد تكوين القلب في الوقت الفعلي والتسجيلات المحتملة الميدانية. تطبيق تكوينات الضرب التلقائي أو لصق. في معلمات الكشف عن الإيقاع، اضبط عتبة الكشف على 300 ميكروفولت، والحد الأدنى لفترة الضرب إلى 250 مللي ثانية، والحد الأقصى لفترة الضرب إلى خمس ثوان.
حدد انحدار متعدد الحدود لحساب مدة جهد الحقل. تحقق مما إذا كانت إشارة النشاط الكهربائي الأساسية ناضجة ومستقرة، واحصل على أنشطة القلب الأساسية لمدة دقيقة إلى ثلاث دقائق. قم بإجراء التسجيل بعد 10 أيام من الطلاء.
استبدل وسيط صيانة iPSC CM البشري بمحلول tyrode ، واسمح للخلايا بالتأقلم لمدة 15 دقيقة. أدخل مستشعرات درجة الحرارة في الغرفة ، وضع طبق 35 ملم في الداخل. اضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
اسحب الماصات الدقيقة من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب ماصة صغيرة. املأ الماصات الدقيقة بالمحلول داخل الخلايا ، وأدخلها في الحامل المتصل بمرحلة الرأس لمكبر صوت مشبك التصحيح. افتح برنامج الاقتناء ، وقم بتحميل بروتوكول تسجيل الجهد المحتمل ، وحدد تكوين مشبك الجهد.
أدخل الماصة الدقيقة في محلول الحمام ، وحدد iPSC CMs البشرية المناسبة ، اضبط وخفض موضع الماصة الدقيقة بجوار الخلية المحددة باستخدام جهاز micromanpulator. عند إدخال طرف الماصة في محلول الحمام، تحقق من مقاومة الماصة على شاشة الذبذبات.
ضع الماصة بالقرب من الخلية ، وستنخفض النبضات الحالية قليلا لتعكس مقاومة الختم المتزايدة. ضع شفط لطيف بضغط سلبي لزيادة المقاومة. هذا سوف يشكل جيجاسيل.
ثم تطبيق وظيفة الختم. ضع شفطا إضافيا لكسر الغشاء للحصول على تكوين تسجيل خلية كامل. عند هذه النقطة، قم بالتبديل من وضع مشبك الجهد إلى وضع المشبك الحالي، أو بدون حقن تيار باستخدام حوار مكبر الصوت.
اضغط على زر التسجيل لإنشاء ملفات التسجيل المحتملة للإجراء وحفظها. قم بإجراء قياس الكالسيوم العابر بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء. قم بإعداد حل tyrode الطازج وحل تحميل Fura-2 AM.
قم بشفط وسيط صيانة iPSC CM البشري ، واغسل الغرف بمحلول tyrode مرتين. ضع 100 ميكرولتر من محلول تحميل Fura-2 AM واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدل حل تحميل Fura-2 AM بمحلول tyrode واحتضنه لمدة خمس دقائق على الأقل لإزالة الأسترة الكاملة من Fura-2 AM. أضف قطرة من زيت الغمر على هدف غمر الزيت 40x لمجهر epifluorescence المقلوب.
ضع غرفة الخلية في محول المرحلة للمجهر. قم بتثبيت أسلاك التحكم في درجة الحرارة في غرفة الحمام ، واضبطها على 37 درجة مئوية. قم بتركيب أقطاب تحفيز المجال الكهربائي ، واضبط النبضات على 0.5 هرتز لمدة 20 مللي ثانية.
قم بتشغيل مصدر ضوء تبديل الطول الموجي فائق السرعة ، واضبطه على 340 نانومتر ووضع التبديل السريع 380 نانومتر. ضع وقت تعرض قدره 20 مللي ثانية لكل من الأطوال الموجية ، ووقت تسجيل قدره 20 ثانية. تسجيل الفيديو الذي يعكس التغيرات في الوقت الحقيقي من الكالسيوم العابر ، وتصدير البيانات إلى جدول بيانات لتحليلها.
تم استخدام الطبقة الأحادية من الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري لقياس حركة الانقباض. كشف تحليل أثر حركة استرخاء الانكماش باستخدام برنامج المحلل عن بداية الانقباضات وذروة الانكماش ونهاية الانكماش وذروة الاسترخاء ونهاية الاسترخاء. لوحظت التغطية الكاملة للطبقة الأحادية من الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري على جميع الأقطاب الكهربائية داخل لوحات مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة.
عكست الأشكال الموجية الناضجة التي سجلها كل قطب كهربائي إمكانات مجال القلب مع خصائص محددة. بعد التحليل ، تم الحصول على فترة الضرب ، ومدة المجال المحتملة ، وسعة السنبلة. سجلت تسجيلات المشبك لرقعة الخلية الكاملة في وضع التثبيت الحالي إمكانات العمل التلقائي للخلايا العضلية القلبية المفردة.
بعد التحليل ، تم الحصول على العديد من المعلمات ، بما في ذلك السعة ، والحد الأقصى للإمكانات الانبساطية ، ومدة العمل المحتملة. بعد تحليل تصوير الكالسيوم ، تم الحصول على نسبة F340 بواسطة F380 بمرور الوقت ، وتم رسم آثار خام لعابرات الكالسيوم المحفزة. بالإضافة إلى ذلك ، تم الحصول على معلمات مثل السعة والكالسيوم الانبساطي وتاو تسوس الكالسيوم.
من المهم استخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشرية التي هي في ظروف ضرب جيدة ، وكذلك لضمان النقاء العالي للخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري. يتضمن هذا البروتوكول أربع تقنيات محددة لدراسة وظائف الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC البشري ، أو التكوين الآخر ، أو التلقائي ما إذا كان لدراسة التيارات الأيونية القلبية التي تلعب دورا حاسما في القلب
