Оценка сердечной безопасности является важным компонентом в процессе разработки препарата. Кардиомиоциты человека, полученные из iPSC, оказались надежной, эффективной и основанной на человеке моделью для доклинической оценки сердечной безопасности. Мы разработали методологии для всестороннего исследования функциональной характеристики кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, которые имеют действительно важное значение для моделирования заболеваний, скрининга сердечной токсичности, вызванной лекарственными средствами, и прецизионной медицины.
Растущее включение кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в стандартный процесс доклинических оценок безопасности может повысить точность прогнозирования токсичности соединений кандидата. Начните с культивирования кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC, в течение не менее 10 дней, прежде чем проводить измерение. Включите регулятор температуры и установите его на 37 градусов по Цельсию.
Включите микроскоп, камеру и подачу углекислого газа. Наполните водяную рубашку держателя пластины соответствующим количеством стерильной деионизированной воды. Поместите пластину с 96 лунками на держатель пластины и инкубируйте клетки в течение не менее пяти минут.
Откройте программное обеспечение для просмотра, затем установите частоту кадров камеры на 75 кадров в секунду, а разрешение видео или изображения на 1024 x 1024 пикселя. Применяйте функции автофокусировки и автоматической яркости, записывайте видео и изображения кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. Осторожно поместите восьмимикролитровую каплю раствора экстра-клеточного матричного покрытия на площадь регистрирующего электрода каждой скважины 48-луночных микроэлектродных пластин.
Затем добавьте три миллилитра стерильной деионизированной воды в область, окружающую колодцы, чтобы предотвратить испарение раствора покрытия. Используя наконечник пипетки объемом 200 микролитров, удалите большую часть дополнительной среды сотовой матрицы с поверхности скважины в пределах одного ряда или колонны, не касаясь электродов. Семена 50 000 клеток на лунку в восьмимикролитровой капле посевной среды над площадью регистрирующего электрода.
Повторяйте до тех пор, пока все колодцы не будут покрыты ячейками. Затем инкубируют микроэлектродные пластины массива в увлажненном инкубаторе клеточной культуры. Медленно добавляйте 150 микролитров посевной среды в каждую лунку пластин микроэлектродного массива.
На 10 день после нанесения покрытия проверьте плотность спонтанного биения монослоя iPSC CM человека под микроскопом. Поместите 48-луночную микроэлектродную пластину в записывающий прибор. Убедитесь, что температура составляет 37 градусов по Цельсию, а углекислый газ составляет 5% Откройте программное обеспечение навигатора.
В окне экспериментальной настройки выберите конфигурацию сердца в реальном времени и записи потенциала поля. Применяйте спонтанные или вставленные конфигурации. В параметрах обнаружения биения установите порог обнаружения равным 300 микровольтам, минимальный период биения — 250 миллисекунд, а максимальный период биения — пять секунд.
Выберите полиномиальную регрессию для вычисления длительности потенциала поля. Проверьте, является ли базовый сигнал электрической активности зрелым и стабильным, и получите базовую сердечную деятельность в течение одной-трех минут. Выполните запись через 10 дней после нанесения покрытия.
Замените человеческую среду для поддержания iPSC CM раствором тирода и дайте клеткам акклиматизироваться в течение 15 минут. Вставьте датчики температуры в камеру и поместите внутрь 35-миллиметровую тарелку. Отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию.
Вытащите микропипетки из боросиликатных стеклянных капилляров с помощью съемника микропипетки. Наполните микропипетки внутриклеточным раствором и вставьте их в держатель, соединенный с головной ступенью патч-зажимного усилителя. Откройте программное обеспечение для сбора данных, загрузите протокол записи потенциала действия и выберите конфигурацию зажима напряжения.
Вставьте микропипетку в раствор ванны и выберите соответствующие одиночные человеческие iPSC CM. Отрегулируйте и опустите положение микропипетки рядом с выбранной ячейкой с помощью микроманипулятора. Когда наконечник пипетки вставлен в раствор ванны, проверьте сопротивление пипетки на мониторе осциллографа.
Расположите пипетку близко к ячейке, и импульсы тока немного уменьшатся, чтобы отразить растущее сопротивление уплотнения. Примените мягкое всасывание с отрицательным давлением, чтобы увеличить сопротивление. Это будет образовывать гигасеал.
Затем примените функцию уплотнения. Примените дополнительное всасывание, чтобы сломать мембрану, чтобы получить целую конфигурацию записи клетки. На этом этапе переключитесь из режима зажима напряжения в режим зажима тока или без впрыска тока с помощью диалога усилителя.
Нажмите кнопку записи, чтобы создать и сохранить файлы записи потенциального действия. Выполняйте измерение преходящего кальция не менее чем через 10 дней после нанесения покрытия. Приготовьте свежий раствор тирода и загрузочный раствор Fura-2 AM.
Аспирируйте человеческую поддерживающую среду iPSC CM и дважды промывайте камеры раствором тирода. Нанесите 100 микролитров загрузочного раствора Фура-2 АМ и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Замените загрузочный раствор Fura-2 AM раствором тирода и инкубируйте в течение не менее пяти минут для полной деэтеризации Fura-2 AM. Добавьте каплю погружного масла на 40-кратный масляный иммерсионный объектив перевернутого эпифлуоресцентного микроскопа.
Поместите клеточную камеру в адаптер ступени микроскопа. Установите провода регулятора температуры в камеру ванны и установите ее на 37 градусов по Цельсию. Установите электроды для стимуляции электрического поля и установите импульсы на 0,5 герц с длительностью 20 миллисекунд.
Включите сверхскоростной источник света переключения длин волн и установите его в режим быстрого переключения 340 нанометров и 380 нанометров. Примените время экспозиции 20 миллисекунд для обеих длин волн и время записи 20 секунд. Запишите видео, отражающее изменения переходного кальция в реальном времени, экспортируйте данные в электронную таблицу для анализа.
Монослой кардиомиоцитов человека, полученный из iPSC, был использован для измерения движения сокращения. Анализ следа релаксационного движения сокращения с помощью анализатора программного обеспечения обнаружил начало сокращений, пик сокращения, конец сокращения, пик релаксации и конец релаксации. Полное покрытие монослоя кардиомиоцитов человека, полученного из iPSC, наблюдалось на всех электродах в пластинах микроэлектродного массива.
Зрелые формы сигналов, записанные каждым электродом, отражали потенциал сердечного поля с идентифицируемыми характеристиками. После анализа были получены период биения, длительность потенциала поля и амплитуда шипа. Записи зажимов цельноклеточных пластырей в текущем режиме зажима регистрировали спонтанные потенциалы действия отдельных кардиомиоцитов.
После анализа было получено несколько параметров, включая амплитуду, максимальный диастолический потенциал и продолжительность потенциала действия. После анализа кальциевой визуализации было получено соотношение F340 к F380 с течением времени, и были нанесены необработанные следы стимулированных переходных процессов кальция. Кроме того, были получены такие параметры, как амплитуда, диастолический кальций и тау распада кальция.
Важно использовать кардиомиоциты человека, полученные из iPSC, которые находятся в хороших условиях биения, а также обеспечить высокую чистоту кардиомиоцитов человека, полученных из iPSC. Этот протокол включает в себя четыре конкретных метода для изучения функциональности кардиомиоцитов человека, полученного из iPSC, другой конфигурации или автоматического изучения сердечных ионных токов, которые играют решающую роль в сердечной деятельности.
