Kardiyak güvenlik değerlendirmesi, ilaç geliştirme sürecinde çok önemli bir bileşendir. İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model olduğu kanıtlanmıştır. Gerçekten önemli hastalık modellemesi, ilaca bağlı kardiyo toksisite taraması ve hassas tıp olan insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturduk.
İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin standart klinik öncesi güvenlik değerlendirme sürecine giderek daha fazla dahil edilmesi, bir adayın bileşiklerinin toksisite tahmininin doğruluğunu artırma potansiyeline sahiptir. Ölçümü yapmadan önce insan iPSC türevi kardiyomiyositleri en az 10 gün boyunca kültürleyerek başlayın. Sıcaklık kontrol cihazını açın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Mikroskop, kamera ve karbondioksit kaynağını açın. Plaka tutucunun su ceketini uygun miktarda steril deiyonize su ile doldurun. 96 kuyucuklu plakayı plaka tutucuya yerleştirin ve hücreleri en az beş dakika boyunca inkübe edin.
Görüntüleme yazılımını açın, ardından fotoğraf makinesi kare hızını saniyede 75 kareye ve video veya görüntü çözünürlüğünü 1024 x 1024 piksele ayarlayın. Otomatik odaklama ve otomatik parlaklık işlevlerini uygulayın, insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin videolarını ve görüntülerini kaydedin. 48 kuyucuklu mikroelektrot dizi plakalarının her bir kuyucuğunun kayıt elektrot alanı üzerine sekiz mikrolitrelik ekstra hücresel matris kaplama çözeltisi damlacığını dikkatlice yerleştirin.
Daha sonra, kaplama çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için kuyuları çevreleyen alana üç mililitre steril deiyonize su ekleyin. 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak, elektrotlara dokunmadan aynı tek sıra veya sütun içindeki kuyu yüzeyinden ekstra hücresel matris ortamının çoğunu çıkarın. Kayıt elektrodu alanı üzerinde sekiz mikrolitrelik bir tohumlama ortamı damlacığında kuyucuk başına 50.000 hücre tohumlayın.
Tüm kuyucuklar hücrelerle kaplanana kadar tekrarlayın. Daha sonra mikroelektrot dizisi plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Mikroelektrot dizi plakalarının her bir kuyucuğuna yavaşça 150 mikrolitre tohumlama ortamı ekleyin.
Kaplama sonrası 10. günde, mikroskop altında spontan dövülen insan iPSC CM monolayer'ın yoğunluğunu kontrol edin. 48 kuyulu mikroelektrot dizi plakasını kayıt cihazına yerleştirin. Sıcaklığın 37 santigrat derece ve karbondioksitin% 5 olduğundan emin olun Navigatör yazılımını açın.
Deney kurulum penceresinde, kardiyak gerçek zamanlı yapılandırmayı ve alan potansiyel kayıtlarını seçin. Kendiliğinden veya yapıştır çırpma yapılandırmaları uygulayın. Vuruş algılama parametrelerinde, algılama eşiğini 300 mikro volta, minimum atma süresini 250 milisaniyeye ve maksimum vuruş süresini beş saniyeye ayarlayın.
Alan potansiyel süresi hesaplaması için polinom regresyonunu seçin. Temel elektriksel aktivite sinyalinin olgun ve kararlı olup olmadığını kontrol edin ve bir ila üç dakika boyunca temel kardiyak aktiviteleri edinin. Kaydı kaplamadan 10 gün sonra gerçekleştirin.
İnsan iPSC CM bakım ortamını tirot çözeltisi ile değiştirin ve hücrelerin 15 dakika boyunca alışmasına izin verin. Sıcaklık sensörlerini odaya yerleştirin ve 35 milimetrelik kabı içine yerleştirin. Sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.
Mikro pipetleri bir mikro pipet çektirici kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan çekin. Mikro pipetleri hücre içi çözelti ile doldurun ve yama kelepçeli amplifikatörün baş aşamasına bağlı tutucuya takın. Edinme yazılımını açın, aksiyon potansiyeli kayıt protokolünü yükleyin ve voltaj kelepçesi yapılandırmasını seçin.
Mikro pipeti banyo çözeltisine yerleştirin ve uygun tek insan iPSC CM'lerini seçin. Bir mikromanipülatör kullanarak seçilen hücrenin yanındaki mikro pipetin konumunu ayarlayın ve alçaltın. Pipet ucu banyo çözeltisine yerleştirildiğinde, osiloskop monitöründe pipet direnci olup olmadığını kontrol edin.
Pipetin hücreye yakın bir yere yerleştirilmesi durumunda, akım darbeleri artan sızdırmazlık direncini yansıtacak şekilde hafifçe azalacaktır. Direnci arttırmak için negatif basınçla nazik bir emme uygulayın. Bu bir gigaseal oluşturacaktır.
Ardından sızdırmazlık fonksiyonunu uygulayın. Tüm hücre kayıt konfigürasyonunu elde etmek için zarı kırmak için ek emme uygulayın. Bu noktada, voltaj kelepçesi modundan akım kelepçesi moduna geçin veya amplifikatör diyaloğunu kullanarak akım enjeksiyonu yapmayın.
Eylem potansiyel kayıt dosyalarını oluşturmak ve kaydetmek için kayıt düğmesine basın. Kalsiyum geçici ölçümünü kaplamadan en az 10 gün sonra yapın. Taze tirot çözeltisi ve Fura-2 yükleme çözeltisi hazırlayın.
İnsan iPSC CM bakım ortamını aspire edin ve odaları tirot çözeltisi ile iki kez yıkayın. 100 mikrolitre Fura-2 yükleme çözeltisi uygulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Fura-2 yükleme solüsyonunu tirot çözeltisi ile değiştirin ve Fura-2'nin tamamen deesterifikasyonu için en az beş dakika inkübe edin. Ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobun 40x yağ daldırma hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin.
Hücre odasını mikroskobun aşama adaptörüne yerleştirin. Sıcaklık kontrol cihazı tellerini banyo odasına takın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Elektrik alan stimülasyon elektrotlarını takın ve darbeleri 20 milisaniyelik bir süre ile 0,5 hertz'e ayarlayın.
Ultra yüksek hızlı dalga boyu anahtarlama ışık kaynağını açın ve 340 nanometre ve 380 nanometre hızlı anahtarlama moduna ayarlayın. Her iki dalga boyu için de 20 milisaniyelik bir pozlama süresi ve 20 saniyelik bir kayıt süresi uygulayın. Kalsiyum geçicisinin gerçek zamanlı değişikliklerini yansıtan videoyu kaydedin, verileri analiz için bir elektronik tabloya aktarın.
Kasılma hareketi ölçümünde insan iPSC türevi kardiyomiyositler tek katmanlı kullanıldı. Analizör yazılımı kullanılarak kasılma gevşeme hareketinin bir izinin analizi, kasılma başlangıcını, kasılma zirvesini, kasılma sonunu, gevşeme zirvesini ve gevşeme ucunu tespit etti. İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin tek katmanının tam kapsamı, mikroelektrot dizi plakalarındaki tüm elektrotlarda gözlendi.
Her elektrot tarafından kaydedilen olgun dalga formları, tanımlanabilir özelliklere sahip kardiyak alan potansiyelini yansıtıyordu. Analizden sonra vuruş periyodu, alan potansiyel süresi ve spike genliği elde edildi. Mevcut kelepçeleme modundaki tüm hücre yaması kelepçe kayıtları, tek kardiyomiyositlerin spontan aksiyon potansiyellerini kaydetti.
Analizden sonra, genlik, maksimum diyastolik potansiyel ve aksiyon potansiyeli süresi dahil olmak üzere çeşitli parametreler elde edildi. Kalsiyum görüntüleme analizinden sonra, zaman içinde F340 ila F380 oranı elde edildi ve uyarılmış kalsiyum geçicilerinin ham izleri çizildi. Ek olarak, genlik, diyastolik kalsiyum ve kalsiyum bozunumu tau gibi parametreler elde edildi.
İyi atma koşullarında olan insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin kullanılması ve insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin yüksek saflığının sağlanması önemlidir. Bu protokol, insan iPSC kaynaklı kardiyomiyosit işlevselliğini, diğer konfigürasyonu veya kardiyakte çok önemli bir rol oynayan kardiyak iyonik akımları incelemek için otomatik olarak çalışmak için dört spesifik teknik içerir.
