심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 인간 iPSC 유래 심근 세포는 전임상 심장 안전성 평가를위한 신뢰할 수 있고 효율적이며 인간 기반 모델로 입증되었습니다. 우리는 매우 중요한 질병 모델링, 약물 유도 심장 독성 검사 및 정밀 의학의 인간 iPSC 유래 심근 세포의 기능적 특성을 종합적으로 조사하기위한 방법론을 수립했습니다.
인간 iPSC 유래 심근 세포가 표준 전임상 안전성 평가 프로세스에 점점 더 많이 통합됨에 따라 후보 화합물의 독성 예측의 정확성을 향상시킬 가능성이 있습니다. 측정을 수행하기 전에 적어도 10일 동안 인간 iPSC 유래 심근세포를 배양함으로써 시작한다. 온도 컨트롤러를 켜고 섭씨 37도로 설정하십시오.
현미경, 카메라 및 이산화탄소 공급을 켭니다. 플레이트 홀더의 워터 재킷에 적절한 양의 멸균 탈이온수를 채웁니다. 96 웰 플레이트를 플레이트 홀더 상에 놓고, 세포를 적어도 5분 동안 배양한다.
보기 소프트웨어를 연 다음 카메라 프레임 속도를 초당 75프레임으로 설정하고 비디오 또는 이미지 해상도를 1024 x 1024픽셀로 설정합니다. 자동 초점 및 자동 밝기 기능을 적용하고 인간 iPSC 유래 심근 세포의 비디오 및 이미지를 녹화합니다. 8 마이크로 리터 방울의 여분의 세포 매트릭스 코팅 용액을 48 웰 미세 전극 어레이 플레이트의 각 웰의 기록 전극 영역 위에 조심스럽게 놓습니다.
그런 다음 코팅 용액 증발을 방지하기 위해 웰 주변 영역에 3 밀리리터의 멸균 탈 이온수를 첨가하십시오. 200 마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 전극을 건드리지 않고 동일한 단일 행 또는 컬럼 내의 웰 표면에서 대부분의 추가 세포 매트릭스 배지를 제거합니다. 시드 50, 000 세포를 기록 전극 영역 위에 8 마이크로리터의 시드 배지 액적에 넣는다.
모든 웰이 셀로 도금 될 때까지 반복하십시오. 그런 다음 미세전극 어레이 플레이트를 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다. 미세 전극 어레이 플레이트의 각 웰에 150 마이크로 리터의 파종 매체를 천천히 첨가합니다.
도금 후 10일째에 현미경으로 자발적으로 박동하는 인간 iPSC CM 단층의 밀도를 확인합니다. 48웰 미세전극 어레이 플레이트를 녹음기에 놓습니다. 온도가 섭씨 37도이고 이산화탄소가 5%탐색기 소프트웨어를 엽니다.
실험 설정 창에서 심장 실시간 구성 및 현장 전위 기록을 선택합니다. 자발적 또는 붙여넣기 박동 구성을 적용합니다. 비트 감지 매개 변수에서 감지 임계값을 300마이크로볼트로, 최소 박동 기간을 250밀리초로, 최대 박동 기간을 5초로 설정합니다.
필드 전위 기간 계산을 위해 다항식 회귀를 선택합니다. 기준선 전기 활동 신호가 성숙하고 안정적인지 확인하고 1-3분 동안 기준선 심장 활동을 획득합니다. 도금 후 10일 후에 녹음을 수행합니다.
인간 iPSC CM 유지 배지를 tyrode의 용액으로 교체하고 세포가 15분 동안 적응하도록 합니다. 챔버에 온도 센서를 삽입하고 35mm 접시를 안에 넣습니다. 온도를 섭씨 37도까지 조정하십시오.
마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 마이크로 피펫을 당깁니다. 마이크로 피펫에 세포 내 용액을 채우고 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 홀더에 삽입합니다. 수집 소프트웨어를 열고 활동 전위 기록 프로토콜을 로드한 다음 전압 클램프 구성을 선택합니다.
마이크로 피펫을 수조 용액에 삽입하고 적절한 단일 인간 iPSC CM을 선택합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 선택한 셀 옆에 있는 마이크로 피펫의 위치를 조정하고 내립니다. 피펫 팁을 수조 용액에 삽입하면 오실로스코프 모니터에서 피펫 저항을 확인하십시오.
피펫을 셀 가까이에 놓으면 전류 펄스가 약간 감소하여 증가하는 밀봉 저항을 반영합니다. 저항을 높이기 위해 음압으로 부드럽게 흡입하십시오. 이것은 기가 씰을 형성 할 것입니다.
그런 다음 씰 기능을 적용하십시오. 추가 흡입을 적용하여 멤브레인을 깨뜨려 전체 셀 기록 구성을 얻습니다. 이 시점에서 전압 클램프 모드에서 전류 클램프 모드로 전환하거나 증폭기 대화 상자를 사용하여 전류 주입 없음으로 전환합니다.
녹화 버튼을 눌러 활동 전위 녹화 파일을 생성하고 저장합니다. 도금 후 최소 10일 후에 칼슘 과도 측정을 수행합니다. 신선한 티로드의 용액과 Fura-2 AM 로딩 용액을 준비하십시오.
인간 iPSC CM 유지 매체를 흡인하고 tyrode의 용액으로 챔버를 두 번 세척합니다. 100 마이크로 리터의 Fura-2 AM 로딩 용액을 적용하고 실온에서 10 분 동안 배양합니다. Fura-2 AM 로딩 용액을 tyrode의 용액으로 교체하고 Fura-2 AM의 완전한 탈에스테르화를 위해 최소 5분 동안 배양합니다. 도립 에피형광 현미경의 40x 오일 이멀젼 대물렌즈에 액침 오일 한 방울을 추가합니다.
현미경의 스테이지 어댑터에 세포실을 놓습니다. 온도 컨트롤러 와이어를 욕조 챔버에 설치하고 섭씨 37도로 설정합니다. 전기장 자극 전극을 설치하고 펄스를 0.5Hz로 설정하고 20밀리초 동안 펄스를 설정합니다.
초고속 파장 스위칭 광원을 켜고 340나노미터 및 380나노미터 고속 스위칭 모드로 설정합니다. 두 파장 모두에 대해 20밀리초의 노출 시간과 20초의 기록 시간을 적용합니다. 과도 칼슘의 실시간 변화를 반영하는 비디오를 녹화하고 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
인간 iPSC 유래 심근세포 단분자층을 수축 운동 측정에 사용하였다. 분석기 소프트웨어를 사용하여 수축 이완 운동의 흔적을 분석한 결과, 수축 시작, 수축 피크, 수축 종료, 이완 피크 및 이완 종료가 검출되었습니다. 인간 iPSC 유래 심근세포 단분자층의 전체 커버리지는 미세전극 어레이 플레이트 내의 모든 전극 상에서 관찰되었다.
각 전극에 의해 기록 된 성숙한 파형은 식별 가능한 특성을 가진 심장 전위를 반영했습니다. 분석 후, 비트 기간, 전위 지속 시간 및 스파이크 진폭이 얻어졌다. 전류 클램핑 모드에서의 전체 세포 패치 클램프 기록은 단일 심근 세포의 자발적인 활동 전위를 기록했습니다.
분석 후, 진폭, 최대 이완기 전위 및 활동 전위 지속 시간을 포함한 여러 매개 변수가 얻어졌습니다. 칼슘 영상의 분석 후, 시간 경과에 따른 F380 비율에 의한 F340을 얻었고, 자극 된 칼슘 과도 현상의 원시 흔적을 플롯했다. 또한 진폭, 이완기 칼슘 및 칼슘 붕괴 타우와 같은 매개 변수가 얻어졌습니다.
양호한 박동 조건에 있는 인간 iPSC 유래 심근세포를 사용하는 것은 물론, 인간 iPSC 유래 심근세포의 고순도를 보장하는 것이 중요하다. 이 프로토콜은 인간 iPSC 유래 심근 세포 기능, 다른 구성 또는 심장에서 중요한 역할을하는 심장 이온 전류를 연구할지 여부를 연구하는 4 가지 특정 기술을 포함합니다.
