Transduzir timócitos imaturos com vetores retrovirais e cultivá-los em células estromais OP9 DL4 é uma técnica desafiadora. Este protocolo detalhado economizará tempo e esforço dos pesquisadores ao otimizar esses sistemas. Esta técnica fornece um sistema in vitro flexível para estudar os efeitos de modificações genéticas em células T imaturas e pode ser útil para estudar o desenvolvimento de células T e câncer.
Quem demonstrará o procedimento será Gisele Rodrigues, bolsista de pós-doutorado do meu laboratório. Para começar, semeie as células produtoras de retrovírus 18 a 24 horas antes da transfecção com 70 a 90% de confluência em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços contendo dois mililitros de célula produtora de retrovírus, ou meio RPC. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para transfectar as células, substitua o meio por meio RPC fresco uma hora antes da transfecção. Preparar misturas de lipofecção diluindo quatro microgramas de DNA contendo dois microgramas de pCL-Eco plasmidial auxiliar e dois microgramas de pMIG plasmidial de transferência em 250 microlitros de meio de soro reduzido e misturar suavemente. Em seguida, misturar 10 microlitros de reagente de transfecção e 250 microlitros de meio de soro reduzido e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.
Após cinco minutos de incubação, combinar o DNA diluído com o reagente de transfecção diluído. Misture delicadamente e incube durante 20 a 25 minutos à temperatura ambiente. Adicione os 500 microlitros da mistura de DNA e reagente de transfecção suavemente ao poço que contém as células produtoras de retrovírus, soltando-as nas células com um movimento circular.
Misture suavemente balançando a placa para frente e para trás e, em seguida, incube a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. Aproximadamente 16 horas após a transfecção, substitua o meio antigo por dois mililitros de meio RPC fresco e continue incubando as células a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas. Para preparar a suspensão unicelular do timócito, coloque um timo colhido de camundongos eutanasiados em cinco mililitros de PBS em uma placa de Petri.
Usando lâminas de vidro estéreis, coloque o timo entre as superfícies foscas das lâminas e esfregue suavemente as lâminas juntas, rolando o timo entre as duas lâminas. Enxaguar as lâminas de vidro para coletar as células e descartar o tecido estromal tímico remanescente. Filtrar cinco mililitros da suspensão tímica através de um filtro de células de 30 ou 40 micrómetros e centrifugar as células a 300 G durante 10 minutos.
Depois de remover o sobrenadante, lise os glóbulos vermelhos adicionando um mililitro de um tampão de lise ACK por tubo por um minuto. Adicione cinco mililitros de tampão de depleção celular para desativar o tampão de lise ACK, centrifugar a suspensão a 300 G por 10 minutos e ressuspender em um a cinco mililitros de tampão de depleção celular para contagem. Após contar as células e centrifugar a 300 G por 10 minutos, ressuspendê-las uma vez de 10 a sétima em 80 microlitros de tampão de depleção celular.
Adicione 10 microlitros cada de microesferas CD4 e CD8 por uma vez 10 às sétimas células. Misture bem e incube por 15 minutos no escuro na geladeira. Em seguida, prepare uma coluna de depleção enxaguando-a com dois mililitros de tampão de depleção e descartando o fluxo.
Lave as células incubadas adicionando um a dois mililitros de tampão de depleção por uma vez 10 as sete células. Centrifugar a 300 G por 10 minutos e descartar o sobrenadante. Em seguida, aplique a suspensão de células ressuspensas na coluna e colete o fluxo de células não marcadas.
Lave a coluna duas vezes com um mililitro de tampão e colete o fluxo. Controlar a eficiência da depleção dividindo os 200 microlitros de células coletadas antes da depleção em quatro tubos FACS, sem coração, CD4 de coloração simples, CD8 de coloração simples e CD4 e CD8 de dupla coloração. Use as amostras não coradas e de coloração única para configurar os parâmetros de citometria de fluxo.
Use os 1.000 microlitros de células coletadas após a depleção para corar para CD4 e CD8 e compare com a amostra de dupla coloração coletada antes da depleção. Para a cultura dos timócitos, colocar de duas a cinco vezes 10 a uma vez 10 a sexta timócitos pós-depleção em um frasco T25 de 80 a 90% de células OP9 DL4 confluentes em meio OP9 contendo citocinas. Incubar a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas em células OP9 DL4.
Para colher o retrovírus, colete o sobrenadante contendo os retrovírus das células transeccionadas inclinando a placa de seis poços e, em seguida, posicionando uma seringa de três a cinco mililitros no fundo da placa enquanto puxa o êmbolo para aspirar o sobrenadante. Filtrar o sobrenadante do retrovírus através de um filtro de seringa de 0,45 micrômetros e coletar o filtrado em um tubo de 50 mililitros. Substitua o meio por dois mililitros de meio RPC fresco e continue a incubar as células a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas para a segunda transdução.
coletar os timócitos da cultura OP9 DL4 por pipetagem agressiva para remover os timócitos e as células OP9 DL4 da superfície do frasco. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de células de 40 micrômetros para remover a maioria das células OP9 DL4 e coletar o filtrado em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar os timócitos e o filtrado a 300 G durante cinco minutos e eliminar o sobrenadante.
Ressuspender os timócitos em 0,5 a um mililitro de meio OP9 com citocinas. Adicione um a dois mililitros de meio RPC contendo o vírus. Em seguida, adicione brometo de hexametrina a oito microgramas por mililitro de suspensão celular total.
Espinocular o conteúdo centrifugando as células a 850 G durante uma hora à temperatura ambiente. Ressuspender as células em seis mililitros de meio OP9 com citocinas por frasco e adicionar a suspensão de volta à monocamada celular OP9 DL4. Incubar a 37 graus Celsius durante a noite.
Repita as etapas de coleta de retrovírus usando um novo poço do sobrenadante celular contendo retrovírus. Manter os timócitos transduzidos em cultura OP9 DL4 por dois a cinco dias ou congelar conforme necessário. A eficiência da depleção foi avaliada em citometria de fluxo marcando a fração celular magneticamente não marcada para CD4 e CD8 após a separação imunomagnética das células e analisando-a em um dot plot bivariante bidimensional.
Um bom rendimento de células duplo-negativas para CD4 e CD8 é de 95% ou mais, como representado aqui. Ao usar vetores que expressam marcadores rastreáveis, como um gene de fluorescência, a transecção e a transdução podem ser avaliadas grosseira e empiricamente por microscopia de fluorescência. A eficiência da transdução foi analisada por meio da coleta dos timócitos da monocamada OP9 DL4.
e observar a expressão de um gene de fluorescência por citometria de fluxo. A eficiência da transdução usando um vetor retroviral vazio com GFP como o gene repórter foi de diferenciação de células T de 84,2% em células OP9 DL4 foi observada quatro dias após a transdução. Análise por citometria de fluxo da diferenciação celular induzida pelo co-cultivo em células OP9 DL4 e expressão transgênica, onde as células foram marcadas para CD4, CD8, CD44 e CD 25.
A transdução de timócitos duplo-negativos com o vetor retroviral vazio pMIG apresentou aproximadamente as mesmas proporções de positivos simples, duplos positivos, duplos negativos e seus subestágios duplo-negativos de um a quatro que os timócitos não transduzidos, indicando que o desenvolvimento das células T não foi afetado pelo processo de transdução. A tarefa mais difícil ao tentar replicar esse protocolo é garantir que os diferentes tipos de células sejam gerenciados simultaneamente de forma coordenada. A superexpressão de oncogenes em timócitos imaturos ocasionalmente pode afetar o desenvolvimento normal de células T, de modo que a imunofenotipagem subsequente por citometria de fluxo é uma maneira útil de aprender qual direção tomar.
O potencial oncogênico das células T transduzidas diferenciadas em células da camada fetal pode ser investigado por injeção em camundongos imunocomprometidos.
