המרת תימוציטים לא בשלים עם וקטורים רטרו-ויראליים וגידול תאים אלה על תאי סטרומה OP9 DL4 היא טכניקה מאתגרת. פרוטוקול מפורט זה יחסוך לחוקרים זמן ומאמץ תוך אופטימיזציה של מערכות אלה. טכניקה זו מספקת מערכת חוץ גופית גמישה לחקר ההשפעות של שינויים גנטיים על תאי T לא בשלים והיא יכולה להיות שימושית לחקר התפתחות תאי T וסרטן.
מי שתדגים את ההליך תהיה ג'יזל רודריגז, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, זרעו את תאי היצרן רטרו-וירוס 18 עד 24 שעות לפני ההדבקה במפגש של 70% עד 90% בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת שש בארות המכילה שני מיליליטר של תא יצרן רטרו-וירוס, או מדיום RPC. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
כדי להדביק את התאים, החלף את המדיום בתווך RPC טרי שעה לפני הטרנספקציה. הכינו תערובות ליפופקציה על ידי דילול ארבעה מיקרוגרם של DNA המכיל שני מיקרוגרם של פלסמיד עוזר pCL-Eco ושני מיקרוגרם של פלסמיד העברה pMIG ב 250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת וערבבו בעדינות. לאחר מכן, מערבבים 10 מיקרוליטר של מגיב transfection ו 250 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר חמש דקות של דגירה, לשלב את ה- DNA המדולל עם מגיב transfection מדולל. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 20 עד 25 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את 500 המיקרוליטרים של תערובת הדנ"א ומגיב הטרנספקציה בעדינות לבאר המכילה את תאי היצרן רטרו-וירוס על ידי השלכתם על התאים בתנועה מעגלית.
מערבבים בעדינות על ידי נדנוד הצלחת קדימה ואחורה ולאחר מכן דוגרים על הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. כ-16 שעות לאחר הטרנספקציה, החליפו את התווך הישן בשני מיליליטר של מדיום RPC טרי והמשיכו לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 24 שעות. כדי להכין את תרחיף התימוציט החד-תאי, הניחו תימוס שנקטף מעכברים שעברו המתת חסד בחמישה מיליליטר PBS בצלחת פטרי.
בעזרת מגלשות זכוכית סטריליות, הניחו את בלוטת התימוס בין המשטחים החלביים של המגלשות ושפשפו בעדינות את המגלשות זו בזו, תוך גלגול בלוטת התימוס בין שתי המגלשות. שטפו את שקופיות הזכוכית כדי לאסוף את התאים ולהשליך את שאריות רקמת הסטרומה התימית. סננו חמישה מיליליטר של התרחיף התימי דרך מסנן מסננת תאים של 30 או 40 מיקרומטר וצנטריפוגו את התאים ב-300 גרם למשך 10 דקות.
לאחר הסרת הסופרנטנט, ליז את תאי הדם האדומים על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ ליזה ACK לכל צינור למשך דקה אחת. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר דלדול תאים כדי להשבית את מאגר ACK lysis, צנטריפוגר את המתלה ב 300 G למשך 10 דקות, והשהה מחדש במיליליטר אחד עד חמישה מיליליטר של מאגר דלדול התא לספירה. לאחר ספירת התאים וצנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות, להשעות את התאים פעם אחת 10 עד השביעי ב 80 מיקרוליטר של מאגר דלדול התא.
הוסף 10 מיקרוליטר כל אחד של microbeads CD4 ו- CD8 לכל אחד כפול 10 לתא השביעי. מערבבים היטב ודגרים במשך 15 דקות בחושך במקרר. לאחר מכן, הכינו עמוד דלדול על ידי שטיפתו בשני מיליליטר של חיץ דלדול והשלכת הזרימה.
שטפו את תאי הדגירה על ידי הוספת מיליליטר עד שני מיליליטר של חיץ דלדול לכל אחד כפול 10 את שבעת התאים. צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant. לאחר מכן, החל את השעיית התא המושעה מחדש על העמודה ואסוף את הזרימה של תאים ללא תווית.
שטפו את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ ואספו את הזרימה. הכתימו את בקרות יעילות הדלדול על ידי פיצול 200 מיקרוליטרים של תאים שנאספו לפני הדלדול לארבע שפופרות FACS, לא מוכתמות, CD4 מוכתם יחיד, CD8 מוכתם יחיד ו- CD4 ו- CD8 מוכתמים כפול. השתמש בדגימות לא מוכתמות ומוכתמות בודדות כדי להגדיר את פרמטרי ציטומטריית הזרימה.
השתמש 1, 000 מיקרוליטר של תאים שנאספו לאחר דלדול כדי להכתים עבור CD4 ו- CD8 והשווה עם הדגימה המוכתמת כפולה שנאספה לפני התרוקנות. כדי לגדל את התימוציטים, הניחו שניים עד חמש פעמים 10 עד החמישית עד אחת פי 10 עד התימוציט השישי לאחר הדלדול לתוך בקבוק T25 של 80% עד 90% תאי OP9 DL4 במדיום OP9 המכיל ציטוקינים. יש לדגור על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 24 שעות על תאי OP9 DL4.
כדי לקצור את הרטרו-וירוס, אספו את הסופרנאטנט המכיל את הרטרו-וירוסים מהתאים שעברו טרנסקטציה על ידי הטיית הצלחת בעלת שש הבארות ולאחר מכן מיקום מזרק של שלושה עד חמישה מיליליטר בתחתית הצלחת תוך משיכת הבוכנה כדי לשאוף את הסופר-נטנט. מסננים את הסופרנאטנט רטרו-וירוס דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר ואוספים את התסנין בצינור של 50 מיליליטר. החלף את המדיום בשני מיליליטר של מדיום RPC טרי והמשך לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות עבור התמרה השנייה.
אספו את התימוציטים מתרבית OP9 DL4 על ידי פיפטינג אגרסיבי כדי להסיר את התימוציטים ואת תאי OP9 DL4 מפני השטח של הבקבוק. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי להסיר את רוב תאי OP9 DL4 ולאסוף את התסנין בצינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגו את התימוציטים ואת התסנין ב 300 גרם במשך חמש דקות ולזרוק את supernatant.
השהה מחדש את התימוציטים ב-0.5 עד מיליליטר אחד של OP9 בינוני עם ציטוקינים. הוסף מיליליטר אחד עד שני מיליליטר של מדיום RPC המכיל את הנגיף. לאחר מכן, להוסיף hexamethrine bromide בשמונה מיקרוגרם למיליליטר של השעיית התא הכוללת.
Spinoculate התוכן על ידי צנטריפוגה התאים ב 850 G במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את התאים בשישה מיליליטר של תווך OP9 עם ציטוקינים לכל בקבוק והוסף את המתלה בחזרה לחד-שכבה של תא OP9 DL4. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה.
חזור על השלבים של קצירת רטרו-וירוס באמצעות באר חדשה של סופרנטנט התאים המכיל רטרו-וירוס. שמרו את התימוציטים המומרים בתרבית OP9 DL4 למשך יומיים עד חמישה ימים או הקפיאו לפי הצורך. יעילות הדלדול הוערכה באופן ציטומטרי על ידי תיוג מקטע התא הבלתי מסומן מגנטית עבור CD4 ו- CD8 לאחר הפרדת תאים אימונומגנטית וניתוח זה על תרשים נקודה דו-ממדי דו-ממדי.
תשואה טובה של תאים שליליים כפולים עבור CD4 ו- CD8 היא 95% ומעלה, כפי שמיוצג כאן. כאשר משתמשים בווקטורים המבטאים סמנים הניתנים לסינון כגון גן פלואורסצנטי, ניתן להעריך באופן גס ואמפירי את הטרנסקציה והטרנסדוקציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יעילות ההולכה נותחה על ידי קצירת התימוציטים מהחד-שכבה OP9 DL4.
והסתכלות על ביטוי של גן פלואורסצנטי על ידי ציטומטריית זרימה. יעילות ההתמרה באמצעות וקטור רטרו-ויראלי ריק עם GFP כגן המדווח הייתה 84.2% התמיינות תאי T בתאי OP9 DL4 נצפתה ארבעה ימים לאחר הטרנסדוקציה. ניתוח ציטומטריית זרימה של התמיינות תאים המושרה על ידי תרבית משותפת על תאי OP9 DL4 וביטוי טרנסגנים, שם התאים סומנו עבור CD4, CD8, CD44 ו- CD 25.
הטרנסדוקציה של תימוציטים שליליים כפולים עם pMIG הווקטורי הרטרו-ויראלי הריק הציגה בערך את אותם פרופורציות של חיוביים בודדים, חיוביים כפולים, שליליים כפולים, ותת-השלבים שלה שליליים כפולים אחד עד ארבעה כמו התימוציטים שלא עברו טרנספורמציה, מה שמצביע על כך שהתפתחות תאי T לא הושפעה מתהליך הטרנסדוקציה. המשימה הקשה ביותר בעת ניסיון לשכפל פרוטוקול זה היא לוודא כי סוגי התאים השונים מנוהלים בו זמנית באופן מתואם. ביטוי יתר של אונקוגנים בתימוציטים לא בשלים מדי פעם יכול להשפיע על התפתחות תקינה של תאי T, ולכן האימונופנוטיפ הבא על ידי ציטומטריית זרימה הוא דרך מועילה ללמוד לאיזה כיוון ללכת.
הפוטנציאל האונקוגני של תאי T מותמרים המתמיינים על תאי שכבת העובר יכול להיחקר עוד יותר על ידי הזרקה לעכברים מדוכאי חיסון.
