Olgunlaşmamış timositlerin retroviral vektörlerle transdüksiyonu ve bu hücrelerin OP9 DL4 stromal hücreler üzerinde kültürlenmesi zorlu bir tekniktir. Bu ayrıntılı protokol, bu sistemleri optimize ederken araştırmacılara zaman ve emek kazandıracaktır. Bu teknik, genetik modifikasyonların olgunlaşmamış T hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için esnek bir in vitro sistem sağlar ve T hücresi gelişimi ve kanseri incelemek için yararlı olabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Gisele Rodrigues olacak. Başlamak için, retrovirüs üretici hücrelerini, transfeksiyondan 18 ila 24 saat önce, iki mililitre retrovirüs üretici hücresi veya RPC ortamı içeren altı kuyucuklu bir doku kültürü plakasının her bir kuyucuğunda% 70 ila% 90 oranında akıcılıkta tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Hücreleri transfekte etmek için, ortamı transfeksiyondan bir saat önce taze RPC ortamı ile değiştirin. İki mikrogram yardımcı plazmid pCL-Eco ve iki mikrogram transfer plazmidi pMIG içeren dört mikrogram DNA'yı 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyrelterek dudak emaneti karışımları hazırlayın ve yavaşça karıştırın. Daha sonra, 10 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 250 mikrolitre azaltılmış serum ortamını karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Beş dakikalık inkübasyondan sonra, seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile birleştirin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 20 ila 25 dakika inkübe edin. DNA ve transfeksiyon reaktif karışımının 500 mikrolitresini retrovirüs üretici hücrelerini içeren kuyucuğa dairesel bir hareketle hücrelerin üzerine bırakarak nazikçe ekleyin.
Plakayı ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın ve ardından plakayı 16 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Transfeksiyondan yaklaşık 16 saat sonra, eski ortamı iki mililitre taze RPC ortamı ile değiştirin ve hücreleri 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin. Timosit tek hücreli süspansiyonunu hazırlamak için, ötenazi farelerden hasat edilmiş bir timüsü bir Petri kabında beş mililitre PBS'ye yerleştirin.
Steril cam slaytlar kullanarak, timusu slaytların buzlu yüzeyleri arasına yerleştirin ve timusu iki slayt arasında yuvarlayarak slaytları hafifçe ovalayın. Hücreleri toplamak ve kalan timik stromal dokuyu atmak için cam slaytları durulayın. Timik süspansiyonun beş mililitresini 30 veya 40 mikrometrelik bir hücre süzgeç filtresinden geçirin ve hücreleri 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, bir dakika boyunca tüp başına bir mililitre ACK lizis tamponu ekleyerek kırmızı kan hücrelerini lize edin. ACK lizis tamponunu devre dışı bırakmak için beş mililitre hücre tükenme tamponu ekleyin, süspansiyonu 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve sayım için bir ila beş mililitre hücre tükenme tamponunda yeniden askıya alın. Hücreleri saydıktan ve 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaptıktan sonra, hücreleri 80 mikrolitre hücre tükenme tamponunda bir kez 10 ila yedinci kez yeniden askıya alın.
Yedinci hücrelere CD4 ve CD8 mikroboncuklarının her birine 10 kez 10 mikrolitre ekleyin. İyice karıştırın ve buzdolabında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Ardından, iki mililitre tükenme tamponu ile durulayarak ve akışı atarak bir tükenme sütunu hazırlayın.
İnkübe edilmiş hücreleri, yedi hücrenin 10 katı başına bir ila iki mililitre tükenme tamponu ekleyerek yıkayın. 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Ardından, yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın ve etiketlenmemiş hücrelerin akışını toplayın.
Kolonu bir mililitre tamponla iki kez yıkayın ve akışı toplayın. Tükenmeden önce toplanan 200 mikrolitre hücreyi, lekesiz, CD4 tek boyalı, CD8 tek boyalı ve CD4 ve CD8 çift boyalı dört FACS tüpüne bölerek tükenme verimliliği kontrollerini lekeleyin. Akış sitometri parametrelerini ayarlamak için lekesiz ve tek boyalı numuneleri kullanın.
CD4 ve CD8 için boyamak için tükenmeden sonra toplanan 1.000 mikrolitre hücreyi kullanın ve tükenmeden önce toplanan çift boyalı numune ile karşılaştırın. Timositleri kültüre almak için, iki ila beş kez 10 ila beşinci ila bir kez 10 ila altıncı tükenme sonrası timositleri, sitokinler içeren OP9 ortamında% 80 ila% 90 oranında birleşen OP9 DL4 hücrelerinden oluşan bir T25 şişesine yerleştirin. Kültürü OP9 DL4 hücrelerinde 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Retrovirüsü hasat etmek için, retrovirüsleri içeren süpernatantı transekte edilmiş hücrelerden toplayın, altı kuyucuklu plakayı eğerek ve daha sonra süpernatanı aspire etmek için pistonu çekerken plakanın altına üç ila beş mililitrelik bir şırınga yerleştirin. Retrovirüs süpernatantını 0,45 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin ve filtratı 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Ortamı iki mililitre taze RPC ortamı ile değiştirin ve ikinci iletim için hücreleri 20 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin.
Timositleri ve OP9 DL4 hücrelerini şişe yüzeyinden çıkarmak için agresif pipetleme ile OP9 DL4 kültüründen timositleri toplayın. Çoğu OP9 DL4 hücresini çıkarmak ve filtratı 50 mililitrelik bir tüpte toplamak için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Timositleri ve filtratı beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Timositleri 0.5 ila bir mililitre OP9 ortamında sitokinlerle yeniden askıya alın. Virüsü içeren bir ila iki mililitre RPC ortamı ekleyin. Daha sonra, toplam hücre süspansiyonunun mililitresi başına sekiz mikrogramda heksametrin bromür ekleyin.
Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca 850 G'de santrifüj ederek içeriği spinuküle edin. Hücreleri altı mililitre OP9 ortamında, şişe başına sitokinlerle yeniden askıya alın ve süspansiyonu OP9 DL4 hücre tek katmanına geri ekleyin. Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Retrovirüs içeren hücre süpernatanının yeni bir kuyusunu kullanarak retrovirüs hasat adımlarını tekrarlayın. Dönüştürülen timositleri OP9 DL4 kültüründe iki ila beş gün bekletin veya gerektiğinde dondurun. Tükenme verimliliği, immünomanyetik hücre ayrımından sonra CD4 ve CD8 için manyetik olarak etiketlenmemiş hücre fraksiyonunu etiketleyerek ve bunu iki boyutlu iki değişkenli bir nokta grafiği üzerinde analiz ederek akış sitometrik olarak değerlendirildi.
CD4 ve CD8 için iyi bir çift negatif hücre verimi, burada gösterildiği gibi% 95 veya üstüdür. Bir floresan geni gibi taranabilir belirteçleri ifade eden vektörler kullanıldığında, transeksiyon ve transdüksiyon floresan mikroskobu ile kabaca ve ampirik olarak değerlendirilebilir. Transdüksiyon verimliliği, etimositlerin OP9 DL4 monolayer'dan toplanmasıyla analiz edildi.
ve akış sitometrisi ile bir floresan geninin ekspresyonuna bakmak. Muhabir gen olarak GFP ile boş bir retroviral vektör kullanılarak transdüksiyonun etkinliği, transdüksiyondan dört gün sonra OP9 DL4 hücrelerinde %84.2 T-hücre farklılaşması olarak gözlendi. OP9 DL4 hücreleri üzerindeki ko-kültür ve hücrelerin CD4, CD8, CD44 ve CD 25 için etiketlendiği transgen ekspresyonu tarafından indüklenen hücre farklılaşmasının akış sitometri analizi.
Çift negatif timositlerin boş retroviral vektör pMIG ile transdüksiyonu, T hücresi gelişiminin transdüksiyon sürecinden etkilenmediğini gösteren, transdübe edilmemiş timositlerle yaklaşık olarak aynı oranlarda tek pozitif, çift pozitif, çift negatif ve alt aşamalarının çift negatif bir ila dört oranlarını sundu. Bu protokolü çoğaltmaya çalışırken en zor görev, farklı hücre türlerinin aynı anda koordineli bir şekilde yönetildiğinden emin olmaktır. Olgunlaşmamış timositlerde onkogenlerin aşırı eksprese edilmesi bazen normal T hücresi gelişimini etkileyebilir, bu nedenle akış sitometrisi ile mümünofenotipleme, hangi yöne gidileceğini öğrenmenin yararlı bir yoludur.
Fetal tabaka hücrelerinde farklılaşan transdüe T hücrelerinin onkojenik potansiyeli, bağışıklık sistemi baskılanmış farelere enjeksiyonla daha fazla araştırılabilir.
