用逆转录病毒载体转导未成熟的胸腺细胞并在OP9 DL4基质细胞上培养这些细胞是一项具有挑战性的技术。这种详细的协议将在优化这些系统的同时节省研究人员的时间和精力。该技术为研究遗传修饰对未成熟T细胞的影响提供了一种灵活的体外系统，可用于研究T细胞发育和癌症。
演示该程序的将是我实验室的博士后研究员吉赛尔·罗德里格斯（Gisele Rodrigues）。首先，在转染前18至24小时以70%至90%汇合度接种逆转录病毒产生细胞，在含有两毫升逆转录病毒产生细胞或RPC培养基的六孔组织培养板的每个孔中。将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。
要转染细胞，请在转染前一小时用新鲜的RPC培养基替换培养基。通过将含有两微克辅助质粒 pCL-Eco 和两微克转移质粒 pMIG 的 4 微克 DNA 稀释在 250 微升还原血清培养基中并轻轻混合来制备脂质转染混合物。接下来，混合10微升转染试剂和250微升还原血清培养基，并在室温下孵育5分钟。
孵育五分钟后，将稀释的DNA与稀释的转染试剂合并。轻轻混合并在室温下孵育 20 至 25 分钟。将500微升DNA和转染试剂混合物轻轻加入含有逆转录病毒产生细胞的孔中，方法是以圆周运动将它们滴到细胞上。
通过来回摇动板轻轻混合，然后将板在 37 摄氏度的培养箱中孵育 16 至 24 小时。转染后约16小时，用两毫升新鲜RPC培养基替换旧培养基，并继续在37摄氏度下孵育细胞20至24小时。为了制备胸腺细胞单细胞悬液，将从安乐死小鼠收获的胸腺放入培养皿中的五毫升PBS中。
使用无菌载玻片，将胸腺放在载玻片的磨砂表面之间，轻轻地将载玻片摩擦在一起，在两个载玻片之间滚动胸腺。冲洗载玻片以收集细胞并丢弃残留的胸腺基质组织。通过 30 或 40 微米的细胞过滤器过滤 5 毫升胸腺悬浮液，并以 300 G 离心细胞 10 分钟。
去除上清液后，每管加入一毫升ACK裂解缓冲液一分钟，以裂解红细胞。加入 5 毫升细胞耗竭缓冲液以停用 ACK 裂解缓冲液，将悬浮液以 300 G 离心 10 分钟，然后重悬于一至五毫升细胞耗竭缓冲液中进行计数。计数细胞并以300G离心10分钟后，在80微升细胞消耗缓冲液中以10倍至第七倍重悬细胞。
向第七个细胞中加入CD4和CD8微珠各10微升，每次10倍。搅拌均匀，在冰箱中避光孵育 15 分钟。接下来，通过用两毫升耗尽缓冲液冲洗并丢弃流出物来制备去除柱。
通过每1次10次7个细胞加入1至2毫升的去除缓冲液来洗涤孵育的细胞。以300G离心10分钟，弃去上清液。然后，将重悬的细胞悬液施加到色谱柱上并收集未标记细胞的流出物。
用一毫升缓冲液洗涤色谱柱两次并收集流出物。通过将去除前收集的 200 μL 细胞分成四个 FACS 管（未染色、CD4 单染色、CD8 单染色以及 CD4 和 CD8 双染色）来染色去除效率对照。使用未染色和单染色样品设置流式细胞术参数。
使用去除后收集的1， 000微升细胞对CD4和CD8进行染色，并与耗尽前收集的双染色样品进行比较。为了培养胸腺细胞，将2至5倍10至10至6倍的去除后胸腺细胞放入含有细胞因子的OP9培养基中的80至90%汇合OP9 DL4细胞的T25烧瓶中。将培养物在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下在 OP9 DL4 细胞上孵育 24 小时。
为了收获逆转录病毒，通过倾斜六孔板，然后将三到五毫升的注射器放在板底部，同时拉动柱塞吸出上清液，从横断面细胞中收集含有逆转录病毒的上清液。通过0.45微米注射器过滤器过滤逆转录病毒上清液，并将滤液收集在50毫升管中。用两毫升新鲜RPC培养基替换培养基，并继续在37摄氏度下孵育细胞20至24小时以进行第二次转导。
通过积极移液从OP9 DL4培养物中收集胸腺细胞，以从烧瓶表面去除胸腺细胞和OP9 DL4细胞。通过40微米细胞过滤器过滤细胞悬液以去除大多数OP9 DL4细胞，并将滤液收集在50毫升管中。将胸腺细胞和滤液以300G离心五分钟，弃去上清液。
将胸腺细胞重悬于含有细胞因子的0.5至1毫升OP9培养基中。加入一至两毫升含有病毒的RPC培养基。然后，以每毫升总细胞悬液8微克加入六氯菊碱溴。
通过在室温下以850G离心细胞一小时来旋转内容物。将细胞重悬于6毫升OP9培养基中，每个烧瓶含有细胞因子，并将悬浮液加回OP9 DL4细胞单层。在 37 摄氏度下孵育过夜。
使用含有逆转录病毒的细胞上清液的新孔重复逆转录病毒收获的步骤。将转导的胸腺细胞保持在OP9 DL4培养物上两到五天或根据需要冷冻。通过标记免疫磁细胞分离后CD4和CD8的磁性未标记细胞组分并在二维双变量点图上进行分析，通过流式细胞术评估去除效率。
CD4和CD8双阴性细胞的良好产量为95%或更高，如此处所示。当使用表达可筛选标记物（如荧光基因）的载体时，可以通过荧光显微镜粗略和经验地评估横切和转导。通过从OP9 DL4单层中收获胸腺细胞来分析转导效率。
并通过流式细胞术观察荧光基因的表达。转导后4天观察到使用以GFP为报告基因的空逆转录病毒载体在OP9 DL4细胞上分化84.2%T细胞的转导效率。在OP9 DL4细胞上共培养和转基因表达诱导的细胞分化的流式细胞术分析，其中细胞被标记为CD4，CD8，CD44和CD 25。
双阴性胸腺细胞与空逆转录病毒载体pMIG的转导呈现与未转导胸腺细胞大致相同的单阳性、双阳性、双阴性比例，其亚阶段双阴性一至四，表明T细胞发育不受转导过程的影响。尝试复制该协议时最困难的任务是确保以协调的方式同时管理不同的细胞类型。未成熟胸腺细胞中过表达癌基因偶尔会影响正常的T细胞发育，因此随后通过流式细胞术进行免疫表型是了解采取哪个方向的有用方法。
通过注射到免疫受损小鼠中，可以进一步研究在胎儿层细胞上分化的转导T细胞的致癌潜力。
