يتمتع لقاح المستحلب النانوي الجديد بمزايا كبيرة في العلاج التكتيكي للمرض. يتم تقليل هذه التأثيرات المحددة من خلال خصائص مثل تقطيع الورم الفريد ، وتحديد تكتيكات محددة ، والسمية الجهازية المنخفضة. نتوقع أن يوفر البروتوكول أدلة تقنية ونظرية للتطوير المستقبلي للقاحات الغشاء المخاطي الببتيد الببتيد الجديدة للخلايا التائية.
ابدأ بخلط ملليجرام واحد من دهون الفوسفورول الأحادي A مع 100 ميكرولتر من DMSO. دوامة لمدة خمس دقائق واتركها تذوب لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. أضف كميا TWEEN 80 و I-OVA.
امزج المكونات وأضف السكوالين. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول MPLA إلى الخليط المحضر. لتحضير لقاح مستحلب النانو ، أضف المحلول المختلط إلى قطرات الماء بنسبة 70٪ تقريبا من الحجم الكلي وحركه برفق للحصول على خليط شفاف وسهل التدفق.
بالنسبة للمقايسات في المختبر ، ابدأ بإحياء الخلايا الظهارية BEAS2B. قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. قم بإذابة قوارير الخلايا المجمدة بسرعة في حمام مائي ، خفف عند 37 درجة مئوية.
بعد الذوبان ، قم بسرعة بسحب الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر ، وأضف ملليلتر من وسط النمو الكامل. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 129 G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المستلق وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر من وسط النمو الكامل.
بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، قم بإزالة المستلق وإضافة ستة ملليلتر من وسط النمو الكامل لإعادة تعليق الخلايا. ثم نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة T25 واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. بمجرد أن تصل كثافة الخلية إلى 80٪ إلى 90٪ ، تخلص من وسط المزرعة واغسل الخلايا مرتين بملليلتر من برنامج تلفزيوني.
أضف ملليلتر واحد من 0.25٪ تريبسين لهضم الخلايا لمدة دقيقة إلى دقيقتين. عند ملاحظة تقريب الخلايا ، أضف على الفور أربعة ملليلتر من وسط النمو الكامل لتحييد التربسين. امزج العينات وشفطها في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي العينات في 129 G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة supinatant وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الكامل RPMI 1640. استخدم 20 ميكرولترا من معلق الخلية لعد الخلايا وقم بتخفيف الخلايا إلى واحد في 10 أس خمس خلايا لكل ملليلتر.
ثم قم بطلاء خلايا BEAS2B بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في 96 لوحة بئر في 100 ميكرولتر من وسط RPMI 1640 الكامل ، واحتضان الألواح مسبقا لمدة 24 ساعة كما هو موضح سابقا. في نهاية الحضانة ، تخلص من المستلق وأضف 100 ميكرولتر من RPMI 1640 إلى كل بئر من لوحة البئر 96. أضف 100 ميكرولتر من كل من مستحلب I-OVA nano ، I-OVA الممزوج ب BNE ، و I-OVA المخفف مسبقا بوسط نمو كامل بتركيزات نهائية مختلفة مع BNE كعنصر تحكم واحتضانه لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
بمجرد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة الوسيط ونقل اللوحة إلى مكان مظلم. أضف 90 ميكرولترا من وسط النمو الكامل و 10 ميكرولتر من محلول CCK8 إلى كل بئر من اللوحة. احتضان اللوحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
قم بقياس امتصاص كل بئر عند 450 نانومتر باستخدام قارئ لوحة يسمى الإنزيم. استخدم أطراف ماصة 10 ميكرولتر لإجراء التحصين الأنفي للفئران باستخدام I-OVA و I-OVA بالإضافة إلى BNE و I-OVA NE لمدة ثلاثة أيام. استخدم BNE و PBA كعنصر تحكم تجريبي.
بعد ذلك ، قم بقطع عينات بسمك ثلاثة ملليمترات تقريبا من أنسجة الأنف بالمقص وضعها في 4٪ بارافورمالدهيد. إزالة أنسجة الرئة وإصلاح أنسجة الأنف والرئة بأكملها في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة. يستخدم TEM و AFM لتقييم الخصائص الأساسية لإمكانات زيتا السطحية وحجم الجسيمات للقاح النانوي.
يتم عرض أحجام الجسيمات ومؤشرات التشتت المتعدد وجهود زيتا وحركة الرحلان الكهربائي ل I-OVA NE في تحليلات استقرار موسين. تبلغ الصلاحية النسبية لخلايا BEAS2B أكثر من 80٪ في الثقافات المعرضة لتركيزات الببتيد المختلفة من I-OVA و BNE + I-OVA و I-OVA NE لمدة 24 ساعة. لم يكن لدى مجموعة I-OVA EN أي سمية مخاطية واضحة أو تلف الأنسجة أو نزيف أو تسلل الخلايا الالتهابية.
استحوذت خلايا BEAS2B الظهارية على المزيد من FITC المسمى I-OVA NE من محلول الماء الخاص بها. تم تحليل تأثير الإطلاق المستدام ل I-OVA NE في المختبر باستخدام نظام IV-IS. كان للقاح I-OVA NE تأثير إطلاق مستدام مقارنة بالمحلول المائي ل I-OVA.
في مجموعة I-OVA NE ، تكون النسبة المئوية لوقت البقاء على قيد الحياة أعلى مقارنة بالمجموعات الأخرى ، وكان حجم الورم أصغر بكثير ، مما يشير إلى أن له تأثير حماية وقائية أفضل من المجموعات الأخرى. في النموذج العلاجي ، كان متوسط وقت البقاء على قيد الحياة مختلفا بشكل كبير بين المجموعات المختلفة. كان حجم الورم في مجموعة I-OVA NE أصغر بكثير من ذلك الموجود في مجموعة I-OVA.
من المهم تحريك الخليط بالتساوي في هذا الإجراء. وإلا فإنه سيقلل من كفاءة اللقاحات النانوية.
