هذا البروتوكول هو أداة مفيدة للغاية لتقييم السمية العامة الأولية على أنواع مختلفة من العينات ، مثل المستخلصات والكسور والمركبات من مصادر طبيعية أو اصطناعية مختلفة. الميزة الرئيسية لبروتوكولنا هي أنه سهل للغاية ورخيص ويمكن استخدامه في العديد من العينات في نفس الوقت. علاوة على ذلك ، تعمل المعدات المصنوعة يدويا على تحسين موثوقية الموقع.
في هذه المرحلة التقنية ، نقوم بإجراء فحص لاختيار العينات بناء على ملف السمية العام الأولي الذي سيخضع لمزيد من الاختبارات المحددة ، مثل خطوط الخلايا الموسعة أو حتى الاختبارات داخل الجسم الحي. يتم استغلال هذه الطريقة بشكل أساسي في مجالات كيمياء المنتجات الطبية وغيرها لفحص العينات الحيوية. يمكن أيضا استخدام بروتوكولنا لأنواع أخرى من العينات مثل أنظمة النانو.
أثناء الأداء لأول مرة ، كن صبورا لأن هذا يحتاج إلى مهارات مراقبة دقيقة والكثير من الاهتمام بجميع المعلمات التي تم الإبلاغ عنها مارسيا فيليب وفيرا إيسكا ، سيساعد طلاب الدكتوراه من مختبرنا في إظهار هذا الإجراء. ابدأ بوضع الحاوية على شكل قمع في الدعم الأسود وتدوير القمع في اتجاه مناسب لرؤية علامة المستوى والصنبور. لجعل معدات الهجرة المصنوعة يدويا تقطع الجزء العلوي من زجاجتين بلاستيكيتين سعة 0.5 لتر للحصول على ارتفاع نهائي يبلغ 12 سم.
قم بإنشاء ثقب بقطر 1.5 سم على جانب واحد وسبعة سنتيمترات من أسفل كل زجاجة وأدخل أنبوبا مطاطيا بطول 13 سم بين الفتحتين. أغلق الفتحات بالغراء الساخن واتركها حتى تجف لمدة 15 دقيقة. ضع الزجاجات على سطح مستو واملأها بالماء للتحقق من عدم وجود تسرب.
أضف 28 جراما من الملح إلى 800 ملليلتر من ماء الصنبور لتحضير محلول الملح الصناعي ، أو ملح الجمبري الملحي بتركيز 35 جراما لكل لتر. امزجه بقضيب التحريك حتى يذوب الملح تماما. لتحضير العينات ، قم بإذابة كمية مناسبة من كل مستخلص ومركب ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، أو DMSO ، بتركيز نهائي يبلغ 10 ملليغرام لكل ملليلتر.
ثم قم بتخفيف 10 ميكرولتر من كل عينة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد باستخدام 990 ميكرولتر من المحلول الملحي الاصطناعي للحصول على تركيز نهائي قدره 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. تحت غطاء الدخان في قارورة Erlenmeyer ، قم بإعداد محلول ثاني كرومات البوتاسيوم في الماء المقطر بتركيز ملليغرام واحد لكل ملليلتر. املأ وعاء الفقس بوسط يصل إلى علامة 500 ملليلتر وأضف ملعقة واحدة ، أو حوالي 0.5 جرام من أكياس الروبيان الملحي إلى محلول الملح.
أغلق الحاوية. ضع مصباحا موجها مباشرة نحو الجهاز وقم بتشغيله. قم بتوصيل نظام مورد الهواء بالموصل الموجود أعلى الجهاز وقم بتشغيل المضخة.
تفقس أكياس الجمبري الملحي في محلول الملح الاصطناعي تحت تهوية قوية وإضاءة مستمرة ودرجة حرارة ثابتة. بعد 24 إلى 48 ساعة ، عندما يفقس البيض ، قم بإيقاف تشغيل مضخة الهواء وانتظر حتى يتم فصل nauplii عن علب البيض الفارغة. لفصل البيض غير المفقس عن nauplii على قيد الحياة ، افتح صنبور المخرج في الأسفل وقم بتفريغ محتوى القمع في إحدى حاويات حاوية معدات الهجرة المصنوعة يدويا.
تأكد من أن المحلول الذي يحتوي على nauplii والبيض المتبقي غير المفقس أقل من مستوى الأنبوب. ضع الجهاز في الحاضنة لمدة أربع ساعات ، ثم في الحاوية الثانية أضف محلول الملح المتبقي فوق ارتفاع الأنبوب. قم بتغطية الحاوية ب nauplii والبيض المتبقي غير المفقس باستخدام رقائق الألومنيوم وضع المصباح على الحاوية الثانية بمحلول الملح فقط.
سوف ينجذب الجمبري الملحي بالضوء ويهاجر من حاوية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى فصل فعال بين البيض والأرتيميا الحية. من حاوية الحصاد ، اجمع 900 ميكرولتر من المحلول الملحي الذي يحتوي على 10 إلى 15 nauplii وضع المحلول في بئر واحد من 24 صفيحة بئر. يتم اختبار جميع العينات في أربعة أضعاف.
أضف 100 ميكرولتر من كل عنصر تحكم سلبي. التحكم الإيجابي ، محلول الملح الاصطناعي ، وكل عينة من العينات إلى الآبار واحتضان اللوحة تحت الإضاءة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، سجل عدد اليرقات الميتة في كل بئر تحت مجهر مجهر عند تكبير 12 ×.
أضف 100 ميكرولتر من محلول ثاني كرومات البوتاسيوم للحث على موت اليرقات الحية المتبقية وانتظر لمدة ست ساعات. احسب إجمالي اليرقة الميتة في كل بئر تحت المجهر وحدد معدل الوفيات وفقا للمعادلة الموضحة على الشاشة. إجراء جميع الاختبارات في ثلاث نسخ وحساب الانحرافات المعيارية.
أخيرا ، عبر عن النتائج كمتوسط لثلاث تجارب مستقلة لكل منها أربعة أضعاف داخلي زائد ، ناقص الانحرافات المعيارية. يظهر في هذا الشكل هيكل المركبات المختارة المستخرجة من أنواع Plectranthus والتي تم الحصول عليها عن طريق شبه التخليق. تظهر في هذه الصورة نوبلي حديث الفقس من أرتيميا سالينا كما يظهر تحت المجهر.
تمثل هذه الصورة الرسومية معدل وفيات الأرتيميا سالينا بعد 24 ساعة من التعرض لأربعة مستخلصات ميثانول من أنواع Plectranthus عند 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. كانت جميع المستخلصات مقبولة من حيث السمية العامة باستخدام هذا الفحص. هنا الملح يتوافق مع محلول الملح أو فارغة.
تم استخدام ثاني كرومات البوتاسيوم كعنصر تحكم إيجابي وتم استخدام DMSO كعنصر تحكم سلبي. أظهرت جميع المستخلصات المختبرة نتائج مشجعة للغاية مع قيم منخفضة جدا لنسب الوفيات مماثلة لتلك المسجلة للفراغ والسيطرة السلبية. يتم عرض معدل وفيات Artemia Salina بعد 24 ساعة من التعرض للمركبات النقية الخمسة عند 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر في هذا الشكل.
من هذه البيانات ، من الواضح أن خمسة فقط تظهر الحد الأدنى من السمية باستخدام هذا الفحص تحتاج إلى تذكر ثلاث خطوات على وجه الخصوص ، الفقس والهجرة والتجميع. وبالتالي ، لدينا روبيان آخر منفصل عن الأعداد التي يجب العمل معها. الموقع الأولي عبارة عن سمية قناة نموذجية بسيطة ومنخفضة التكلفة مقارنة بالمواقع الأخرى مثل زراعة الخلايا أو أسماك الحمار الوحشي.
علاوة على ذلك ، يمكن بعد ذلك استغلال مواقع السمية الخلوية الأكثر تكلفة.
