使用 卤虫 盐L的致死性生物测定。

该协议是对不同类型的样品（例如来自不同天然或合成来源的提取物，馏分和化合物）进行初步一般毒性评估的非常有用的工具。我们的实验方案的主要优点是它非常简单且便宜，可以同时用于许多样品。此外，手工制作的设备提高了现场的可靠性。

在这个技术阶段，我们进行筛选，根据其初步的一般毒性特征选择样品，这些样品将接受进一步的特定测试，例如膨胀细胞系甚至体内测试。该方法主要用于医药和其他产品化学领域，以筛选生物样品。我们的协议也可用于其他类型的样品，如纳米系统。

第一次表演时，请耐心等待，因为这需要良好的观察技巧和对报告的所有参数的大量关注 Marcia Filipe 和 Vera Isca，我们实验室的博士生将帮助演示此过程。首先将漏斗形容器放在黑色支架中，然后将漏斗向合适的方向转动以查看水平标记和水龙头。为了使手工迁移设备切割两个0.5升塑料瓶的顶部，以获得12厘米的最终高度。

在每个瓶子的一侧创建一个直径为1.5厘米的孔，从每个瓶子的底部开出7厘米的孔，并在两个开口之间插入一根13厘米的橡胶管。用热胶密封开口，晾干15分钟。将瓶子放在平坦的表面上并装满水以验证没有泄漏。

在800毫升自来水中加入28克盐，制备人工盐溶液，或以每升35克的浓度加入盐水虾盐。用搅拌棒混合，直到所有盐完全溶解。为了制备样品，以每毫升10毫克的终浓度溶解适量的每种提取物和化合物二甲基亚砜或DMSO。

然后使用990微升人工盐水溶液在新的微量离心管中稀释每个样品10微升，以获得每毫升0.1毫克的终浓度。在锥形瓶的通风橱下，在蒸馏水中制备浓度为每毫升一毫克的重铬酸钾溶液。用培养基填充孵化容器至500毫升标记，并在盐溶液中加入一勺或约0.5克盐水虾囊肿。

关闭容器。将灯直接指向设备并打开。将空气供应系统连接到放置在设备顶部的连接器上，然后打开泵。

盐水虾囊肿在人工盐溶液中在剧烈曝气、连续光照和稳定温度下孵化。24至48小时后，当卵孵化后，关闭气泵，等待无节幼体与空蛋壳分离。要将未孵化的卵与活的无节幼体分离，请打开底部的出口水龙头，然后将漏斗的内容物排放到手工迁移设备容器的一个容器中。

确保含有无节幼体和残留未孵化卵的溶液低于试管水平。将设备放入培养箱中四个小时，然后在第二个容器中加入管高度以上的残留盐溶液。用铝箔覆盖容器和残留的未孵化卵，并将灯放在第二个容器上，只用盐溶液。

盐水虾会被光线吸引并从一个容器迁移到另一个容器，从而有效地分离卵和活卤虫。从收获容器中收集含有10至15个无节幼体的900微升盐溶液，并将溶液放入24孔板的一个孔中。所有样品一式四份进行测试。

加入每个阴性对照100微升。阳性对照，将人工盐溶液和每个样品放入孔中，并在照明下孵育板24小时。24小时后，在双目显微镜下以12倍放大倍率记录每个孔中死亡幼虫的数量。

加入100微升重铬酸钾溶液，诱导剩余活幼虫死亡，等待6小时。在显微镜下计算每个孔中的死亡幼虫总数，并根据屏幕上显示的方程式确定死亡率。一式三份执行所有测试并计算标准偏差。

最后，将结果表示为三个独立实验的平均值，每个实验具有内部四份正负标准差。从紫薇属中提取并通过半合成获得的选定化合物的结构如图所示。在显微镜下看到的盐卤虫新孵化的无节幼体如图所示。

该图形图像表示盐藻卤虫暴露于四种甲醇提取物24小时后的死亡率，每毫升0.1毫克。使用该测定法，所有提取物在一般毒性方面都是可接受的。这里的盐对应于盐溶液或空白。

重铬酸钾用作阳性对照，DMSO用作阴性对照。所有测试的提取物都显示出非常令人鼓舞的结果，死亡率百分比值非常低，与空白对照和阴性对照相当。该图显示了盐碱卤虫暴露于五种纯化合物24小时后的死亡率为每毫升0.1毫克。

从这些数据中可以明显看出，只有五种显示使用该测定的最小毒性 您需要特别记住三个步骤，孵化，迁移和收集。因此，我们分离出其他虾和数量。与细胞培养或斑马鱼等其他部位相比，初步位点是一个简单且低成本的通道毒性模型。

此外，可以利用更昂贵的细胞毒性位点。