Questo protocollo è uno strumento molto utile per una valutazione preliminare della tossicità generale su diversi tipi di campioni, come estratti, frazioni e composti provenienti da diverse fonti naturali o sintetiche. Il vantaggio principale del nostro protocollo è che è molto facile ed economico e può essere utilizzato su molti campioni contemporaneamente. Inoltre, l'attrezzatura fatta a mano migliora l'affidabilità del sito.
In questa fase tecnica, eseguiamo uno screening per selezionare i campioni in base al loro profilo preliminare di tossicità generale che saranno sottoposti a ulteriori test specifici, come linee cellulari espansive o anche test in vivo. Questo metodo viene utilizzato principalmente nel campo della chimica farmaceutica e di altri prodotti per lo screening di campioni biotici. Il nostro protocollo può essere utilizzato anche per altri tipi di campioni come i nanosistemi.
Mentre esegui per la prima volta, sii paziente perché questo richiede capacità di osservazione fine e molta attenzione a tutti i parametri riportati Marcia Filipe e Vera Isca, i dottorandi del nostro laboratorio aiuteranno a dimostrare questa procedura. Inizia posizionando il contenitore a forma di imbuto nel supporto nero e ruotando l'imbuto in una direzione adatta per vedere il segno di livello e il rubinetto. Per realizzare l'attrezzatura di migrazione fatta a mano tagliare la parte superiore di due bottiglie di plastica da 0,5 litri per ottenere un'altezza finale di 12 centimetri.
Creare un foro di 1,5 centimetri di diametro su un lato e sette centimetri dal fondo di ogni bottiglia e inserire un tubo di gomma di 13 centimetri tra le due aperture. Sigillare le aperture con colla a caldo e lasciarle asciugare per 15 minuti. Metti le bottiglie su una superficie piana e riempile d'acqua per verificare che non ci siano perdite.
Aggiungere 28 grammi di sale a 800 millilitri di acqua di rubinetto per preparare la soluzione salina artificiale, o sale di gamberetti in salamoia ad una concentrazione di 35 grammi per litro. Mescolare con una bacchetta di agitazione fino a quando tutto il sale è completamente sciolto. Per preparare i campioni sciogliere una quantità adeguata di ciascun estratto e composto dimetilsolfossido, o DMSO, ad una concentrazione finale di 10 milligrammi per millilitro.
Quindi diluire 10 microlitri di ciascun campione in una nuova provetta da microcentrifuga utilizzando 990 microlitri di soluzione salina artificiale per ottenere una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro. Sotto una cappa aspirante in un matraccio Erlenmeyer, preparare una soluzione di dicromato di potassio in acqua distillata ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro. Riempire la nave da cova con il mezzo fino al segno di 500 millilitri e aggiungere un cucchiaio o circa 0,5 grammi di cisti di gamberetti di salamoia alla soluzione salina.
Chiudere il contenitore. Posizionare una lampada rivolta direttamente verso l'apparecchiatura e accenderla. Collegare il sistema di alimentazione dell'aria al connettore posto sopra l'apparecchiatura e accendere la pompa.
Le cisti di salamoia si schiudono nella soluzione salina artificiale sotto aerazione vigorosa, illuminazione continua e temperatura stabile. Dopo 24-48 ore, quando le uova si sono schiuse, spegnere la pompa dell'aria e attendere che i naupli siano separati dalle casse vuote delle uova. Per separare le uova non schiuse dai naupli vivi, aprire il rubinetto di uscita nella parte inferiore e scaricare il contenuto dell'imbuto in uno dei contenitori del contenitore dell'attrezzatura di migrazione fatto a mano.
Assicurarsi che la soluzione contenente i naupli e le uova residue non schiuse sia al di sotto del livello del tubo. Posizionare l'apparecchiatura nell'incubatore per quattro ore, quindi nel secondo contenitore aggiungere la soluzione salina residua sopra l'altezza del tubo. Coprire il contenitore con naupli e le uova residue non schiuse usando un foglio di alluminio e posizionare la lampada sul secondo contenitore con solo la soluzione salina.
I gamberetti di salamoia saranno attratti dalla luce e migreranno da un contenitore all'altro, portando a una separazione efficiente tra uova e artemia viva. Dal contenitore di raccolta, raccogliere 900 microlitri di soluzione salina contenente da 10 a 15 naupli e posizionare la soluzione in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Tutti i campioni sono testati in quadruplicati.
Aggiungere 100 microlitri di ciascun controllo negativo. Controllo positivo, la soluzione salina artificiale, e ciascuno dei campioni ai pozzetti e incubare la piastra sotto illuminazione per 24 ore. Dopo 24 ore, registrare il numero di larve morte in ciascun pozzetto al microscopio binoculare con un ingrandimento 12x.
Aggiungere 100 microlitri di soluzione di bicromato di potassio per indurre la morte delle restanti larve viventi e attendere sei ore. Conta la larva morta totale in ciascun pozzetto al microscopio e determina il tasso di mortalità in base all'equazione mostrata sullo schermo. Eseguire tutti i test in triplice copia e calcolare le deviazioni standard.
Infine, esprimere i risultati come media di tre esperimenti indipendenti ciascuno con quadruplicati interni più, meno deviazioni standard. In questa figura è mostrata la struttura dei composti selezionati estratti dalle specie di Plectranthus e ottenuti per semisintesi. Un naupli appena schiuto di Artemia Salina visto al microscopio è mostrato in questa immagine.
Questa immagine grafica rappresenta il tasso di mortalità di Artemia Salina dopo 24 ore di esposizione a quattro estratti di metanolo delle specie di Plectranthus a 0,1 milligrammi per millilitro. Tutti gli estratti erano accettabili in termini di tossicità generale utilizzando questo test. Qui il sale corrisponde alla soluzione salina o al bianco.
Il dicromato di potassio è stato utilizzato come controllo positivo e il DMSO è stato utilizzato come controllo negativo. Tutti gli estratti testati hanno mostrato risultati molto incoraggianti con valori molto bassi di percentuali di mortalità paragonabili a quelli registrati per il bianco e il controllo negativo. Il tasso di mortalità di Artemia Salina dopo 24 ore di esposizione ai cinque composti puri a 0,1 milligrammi per millilitro è presentato in questa figura.
Da questi dati, è evidente che solo cinque mostrano una tossicità minima utilizzando questo test È necessario ricordare tre passaggi in particolare, schiusa, migrazione e raccolta. Di conseguenza, abbiamo altri gamberetti separati e i numeri con cui lavorare. Il sito preliminare è un modello di tossicità del canale semplice e a basso costo rispetto ad altri siti come la coltura cellulare o il pesce zebra.
Inoltre, possono essere sfruttati siti di citotossicità più costosi.
