Este protocolo é uma ferramenta muito útil para uma avaliação preliminar geral da toxicidade em diferentes tipos de amostras, como extratos, frações e compostos de diferentes fontes naturais ou sintéticas. A principal vantagem do nosso protocolo é que ele é muito fácil e barato e pode ser usado em muitas amostras ao mesmo tempo. Além disso, o equipamento artesanal melhora a confiabilidade do local.
Nesta etapa da técnica, fazemos uma triagem para selecionar as amostras com base em seu perfil preliminar de toxicidade geral que serão submetidas a outros testes específicos, como linhagens celulares expansivas ou mesmo testes in vivo. Este método é explorado principalmente em campos químicos medicinais e outros produtos para rastrear amostras bióticas. Nosso protocolo também pode ser usado para outros tipos de amostras, como nanossistemas.
Ao realizar pela primeira vez, seja paciente, pois isso requer habilidades de observação finas e muita atenção a todos os parâmetros relatados Marcia Filipe e Vera Isca, os alunos de doutorado do nosso laboratório ajudarão a demonstrar esse procedimento. Comece colocando o recipiente em forma de funil no suporte preto e girando o funil em uma direção adequada para ver a marca de nível e a torneira. Para fazer o equipamento de migração artesanal corte a parte superior de duas garrafas plásticas de 0,5 litro para obter uma altura final de 12 centímetros.
Crie um orifício de 1,5 centímetro de diâmetro de um lado e sete centímetros do fundo de cada garrafa e insira um tubo de borracha de 13 centímetros entre as duas aberturas. Sele as aberturas com cola quente e deixe-as secar por 15 minutos. Coloque as garrafas em uma superfície plana e encha-as com água para verificar se não há vazamento.
Adicione 28 gramas do sal a 800 mililitros de água da torneira para preparar a solução salina artificial, ou sal de camarão de salmoura a uma concentração de 35 gramas por litro. Misture com uma haste de agitação até que todo o sal esteja completamente dissolvido. Para preparar as amostras dissolver uma quantidade adequada de cada extrato e composto dimetilsulfóxido, ou DMSO, a uma concentração final de 10 miligramas por mililitro.
Em seguida, diluir 10 microlitros de cada amostra em um novo tubo de microcentrífuga usando 990 microlitros da solução salina artificial para obter uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro. Sob um exaustor num balão de Erlenmeyer, preparar uma solução de dicromato de potássio em água destilada a uma concentração de um miligrama por mililitro. Encha o recipiente de eclosão com o meio até a marca de 500 mililitros e adicione uma colher, ou aproximadamente 0,5 gramas de cistos de camarão de salmoura à solução salina.
Feche o contêiner. Coloque uma lâmpada apontando diretamente para o equipamento e ligue-a. Conecte o sistema do fornecedor de ar ao conector colocado na parte superior do equipamento e ligue a bomba.
Os cistos de camarão de salmoura eclodem na solução salina artificial sob aeração vigorosa, iluminação contínua e temperatura estável. Após 24 a 48 horas, quando os ovos tiverem eclodido, desligue a bomba de ar e espere até que os náuplios sejam separados das caixas de ovos vazias. Para separar os ovos não eclodidos dos náuplios vivos, abra a torneira de saída no fundo e descarregue o conteúdo do funil em um dos recipientes do recipiente de equipamento de migração artesanal.
Certifique-se de que a solução que contém os náuplios e os ovos residuais não eclodidos está abaixo do nível do tubo. Coloque o equipamento na incubadora por quatro horas e, em seguida, no segundo recipiente, adicione a solução salina residual acima da altura do tubo. Cubra o recipiente com náuplios e os ovos residuais não chocados usando papel alumínio e coloque a lâmpada no segundo recipiente apenas com a solução salina.
O camarão de salmoura será atraído pela luz e migrará de um recipiente para outro, levando a uma separação eficiente entre ovos e artemia viva. Do recipiente de colheita, coletar 900 microlitros de solução salina contendo 10 a 15 náuplios e colocar a solução em um poço de uma placa de 24 poços. Todas as amostras são testadas em quadruplicados.
Adicione 100 microlitros de cada controle negativo. Controle positivo, a solução salina artificial e cada uma das amostras para os poços e incubar a placa sob iluminação por 24 horas. Após 24 horas, registre o número de larvas mortas em cada poço sob um microscópio binocular com 12 x de ampliação.
Adicione 100 microlitros de solução de dicromato de potássio para induzir a morte das larvas vivas restantes e aguarde seis horas. Conte o total de larvas mortas em cada poço sob um microscópio e determine a taxa de mortalidade de acordo com a equação mostrada na tela. Realizar todos os testes em triplicados e calcular os desvios-padrão.
Finalmente, expresse os resultados como a média de três experimentos independentes, cada um com quadruplicados internos mais, menos desvios padrão. A estrutura dos compostos selecionados extraídos de espécies de Plectranthus e obtidos por semi-síntese são mostrados nesta figura. Um náuplio recém-eclodido de Artemia Salina como visto sob o microscópio é mostrado nesta imagem.
Esta imagem gráfica representa a taxa de mortalidade de Artemia Salina após 24 horas de exposição a quatro extratos metanólicos de espécies de Plectranthus a 0,1 miligramas por mililitro. Todos os extratos foram aceitáveis em termos de toxicidade geral utilizando este ensaio. Aqui o sal corresponde à solução salina ou em branco.
O dicromato de potássio foi utilizado como controle positivo e o DMSO como controle negativo. Todos os extratos testados apresentaram resultados muito animadores com valores muito baixos de percentuais de mortalidade comparáveis aos registrados para o controle em branco e negativo. A taxa de mortalidade de Artemia Salina após 24 horas de exposição aos cinco compostos puros a 0,1 miligramas por mililitro é apresentada nesta figura.
A partir desses dados, é evidente que apenas cinco mostra toxicidade mínima usando este ensaio Você precisa lembrar três etapas em particular, eclosão, migração e coleta. Consequentemente, temos outros camarões separados e os números para trabalhar. O local preliminar é um modelo simples e de baixo custo de toxicidade do canal em comparação com outros locais, como cultura de células ou peixe-zebra.
Além disso, locais de citotoxicidade mais caros podem então ser explorados.
