Bu protokol, farklı doğal veya sentetik kaynaklardan elde edilen ekstraktlar, fraksiyonlar ve bileşikler gibi farklı numune türleri üzerinde ön genel toksisite değerlendirmesi için çok yararlı bir araçtır. Protokolümüzün temel avantajı, çok kolay ve ucuz olması ve aynı anda birçok örnekte kullanılabilmesidir. Ayrıca, el yapımı ekipman sitenin güvenilirliğini artırır.
Bu teknik aşamasında, numuneleri, geniş hücre hatları ve hatta in-vivo testler gibi daha spesifik testlere tabi tutulacak ön genel toksisite profillerine göre seçmek için bir tarama yapıyoruz. Bu yöntem esas olarak biyotik numuneleri taramak için tıbbi ve diğer ürünler kimyası alanlarında kullanılmaktadır. Protokolümüz nanosistemler gibi diğer örnekler için de kullanılabilir.
İlk kez performans gösterirken, sabırlı olun çünkü bu iyi gözlem becerileri gerektirir ve Marcia Filipe ve Vera Isca'nın bildirdiği tüm parametrelere çok dikkat edilmesi gerekir, laboratuvarımızdaki doktora öğrencileri bu prosedürü göstermeye yardımcı olacaktır. Huni şeklindeki kabı siyah desteğe yerleştirerek ve seviye işaretini ve musluğu görmek için huniyi uygun bir yöne çevirerek başlayın. El yapımı göç ekipmanını yapmak için, 12 santimetrelik son bir yükseklik elde etmek için iki adet 0,5 litrelik plastik şişenin üstünü kesin.
Bir tarafta 1,5 santimetre çapında ve her şişenin dibinden yedi santimetre çapında bir delik oluşturun ve iki açıklık arasına 13 santimetrelik bir lastik tüp yerleştirin. Açıklıkları sıcak tutkalla kapatın ve 15 dakika kurumaya bırakın. Şişeleri düz bir yüzeye koyun ve sızıntı olmadığından emin olmak için suyla doldurun.
Yapay tuz çözeltisini hazırlamak için 800 mililitre musluk suyuna 28 gram tuz ekleyin veya litre başına 35 gram konsantrasyonda salamura karides tuzu ekleyin. Tüm tuz iyice çözülene kadar bir karıştırma çubuğuyla karıştırın. Numuneleri hazırlamak için, her bir ekstraktın uygun bir miktarını ve bileşik dimetilsülfoksit veya DMSO'yu, mililitre başına 10 miligramlık bir nihai konsantrasyonda çözün.
Daha sonra, mililitre başına 0.1 miligramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 990 mikrolitre yapay tuzlu su çözeltisi kullanarak her numunenin 10 mikrolitresini yeni bir mikro santrifüj tüpünde seyreltin. Bir Erlenmeyer şişesindeki bir duman başlığının altında, mililitre başına bir miligram konsantrasyonda damıtılmış suda bir potasyum dikromat çözeltisi hazırlayın. Kuluçkalık kabı 500 mililitre işaretine kadar olan ortamla doldurun ve tuz çözeltisine bir kaşık veya yaklaşık 0,5 gram tuzlu su karides kisti ekleyin.
Kapsayıcıyı kapatın. Doğrudan ekipmana doğru işaret eden bir lamba yerleştirin ve açın. Hava tedarikçi sistemini ekipmanın üzerine yerleştirilen konektöre takın ve pompayı açın.
Salamura karides kistleri, güçlü havalandırma, sürekli aydınlatma ve sabit sıcaklık altında yapay tuz çözeltisinde yumurtadan çıkar. 24 ila 48 saat sonra, yumurtalar yumurtadan çıktığında, hava pompasını kapatın ve nauplii boş yumurta kutularından ayrılana kadar bekleyin. Yumurtadan çıkmamış yumurtaları canlı nauplii'den ayırmak için, alttaki çıkış musluğunu açın ve huninin içeriğini el yapımı göç ekipmanı kabının kaplarından birine boşaltın.
Nauplii ve artık yumurtadan çıkmamış yumurtaları içeren çözeltinin tüp seviyesinin altında olduğundan emin olun. Ekipmanı dört saat boyunca inkübatöre yerleştirin, ardından ikinci kaba artık tuz çözeltisini tüpün yüksekliğinin üzerine ekleyin. Kabı nauplii ve artık yumurtadan çıkmamış yumurtaları alüminyum folyo kullanarak örtün ve lambayı sadece tuz çözeltisi ile ikinci kaba yerleştirin.
Salamura karidesi ışıktan etkilenecek ve bir kaptan diğerine göç edecek ve yumurtalar ile canlı artemi arasında etkili bir ayrıma yol açacaktır. Hasat kabından, 10 ila 15 nauplii içeren 900 mikrolitre tuzlu su çözeltisi toplayın ve çözeltiyi 24 kuyucuklu bir plakanın bir oluğuna yerleştirin. Tüm numuneler kuadruplikatlar halinde test edilir.
Her negatif kontrolden 100 mikrolitre ekleyin. Pozitif kontrol, yapay tuz çözeltisi ve numunelerin her biri kuyucuklara gider ve plakayı 24 saat boyunca aydınlatma altında inkübe eder. 24 saat sonra, her bir kuyucuktaki ölü larva sayısını dürbün mikroskobu altında 12 x büyütmede kaydedin.
Kalan canlı larvaların ölümüne neden olmak için 100 mikrolitre potasyum dikromat çözeltisi ekleyin ve altı saat bekleyin. Her bir kuyucuktaki toplam ölü larvaları mikroskop altında sayın ve ekranda gösterilen denkleme göre ölüm oranını belirleyin. Tüm testleri üçlü olarak gerçekleştirin ve standart sapmaları hesaplayın.
Son olarak, sonuçları, her biri iç dörtlü artı eksi standart sapmalara sahip üç bağımsız deneyin ortalaması olarak ifade edin. Plectranthus türlerinden ekstrakte edilen ve yarı sentez ile elde edilen seçilmiş bileşiklerin yapısı bu şekilde gösterilmiştir. Artemia Salina'nın mikroskop altında görüldüğü gibi yeni yumurtadan çıkmış bir nauplii bu resimde gösterilmiştir.
Bu grafiksel görüntü, Plectranthus türlerinin dört metanol ekstraktına mililitre başına 0.1 miligramda 24 saat maruz kaldıktan sonra Artemia Salina'nın ölüm oranını temsil etmektedir. Tüm ekstraktlar bu tahlil kullanılarak genel toksisite açısından kabul edilebilirdi. Burada tuz, tuz çözeltisine veya boşluğa karşılık gelir.
Potasyum dikromat pozitif kontrol olarak, DMSO ise negatif kontrol olarak kullanıldı. Test edilen tüm ekstraktlar, boş ve negatif kontrol için kayıtlı olanlarla karşılaştırılabilir çok düşük ölüm yüzdeleri değerleriyle çok cesaret verici sonuçlar göstermiştir. Artemia Salina'nın beş saf bileşiğe mililitre başına 0.1 miligramda 24 saat maruz kaldıktan sonra ölüm oranı bu şekilde sunulmuştur.
Bu verilerden, sadece beşinin bu tahlili kullanarak minimum toksisite gösterdiği açıktır Özellikle üç adımı hatırlamanız gerekir, kuluçkalama, göç ve toplama. Sonuç olarak, ayrılan başka karideslerimiz ve çalışılacak sayılarımız var. Ön bölge, hücre kültürü veya zebra balığı gibi diğer bölgelere kıyasla basit ve düşük maliyetli bir model kanal toksisitesidir.
Ayrıca, daha pahalı sitotoksisite bölgeleri daha sonra kullanılabilir.
