يمكن تحقيق العلاج الفردي لمرضى التليف الكيسي من خلال نموذج مرض في المختبر لفهم نشاط CFTR عند خط الأساس. تنتج المواد العضوية الظهارية الأنفية البشرية ، أو عضويات HNE ، لومن بأحجام مختلفة ترتبط بنشاط CFTR ، وتميز بين المواد العضوية CF وغير CF. هنا ، وصفنا منهجية لزراعة وتصوير هذه المواد العضوية HNE بالتفصيل.
يؤدي انتقال الأيونات الظهارية المختلة وظيفيا ، وخاصة الكلوريد والبيكربونات ، إلى انخفاض حجم سوائل البطانة الظهارية. هذا يؤثر أيضا على إفرازات المخاط مما يؤدي إلى داء المخاط وانسداده. لذلك ، تم تطوير نموذج HNE الخاص بنا لتطبيقات مختلفة ، اعتمادا على التصميم التجريبي للباحث وموارده.
بصرف النظر عن تقييم نشاط CFTR عند خط الأساس أو استجابة للعلاجات ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أمراض أخرى تنطوي على وظيفة الخلية الظهارية ، وخاصة نقل سوائل الخلايا الظهارية. تم تطوير هذه الطرق في المقام الأول لاستخدامها في دراسات التليف الكيسي. قد تجد الدراسات الأخرى التي تقيم ظهارة مجرى الهواء ، مثل خلل الحركة الهدبي الأولي ، هذه الطرق مفيدة أيضا.
تتطلب هذه التقنيات الاهتمام بالتفاصيل والدقة. كما أنها تتطلب مراقبة دقيقة لضمان أن التوسع الأولي للخلايا مناسب. راقب جميع الثقافات كل يوم ، وسيكون النجاح أكثر احتمالا.
للبدء ، قم بفصل خزعة فرشاة الأنف إلى 8 ميللتر من وسائط RPMI في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر عن طريق تمرير فرشاة علم الخلايا عدة مرات من خلال طرف ماصة كبير التجويف واحد ملليلتر. الطرد المركزي للخلايا في 500 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت ثم أعد تعليق حبيبة الخلية في ثلاثة ملليلترات من محلول انفصال الخلية.
حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 دقيقة للهضم. استخدم خمسة ملليلترات من وسائط التمدد لغسل الخلايا مرتين. ثم ، أضفها إلى قارورة T75 ، المبذرة مسبقا بالخلايا الليفية المشععة والمعطلة و 50 إلى 60٪ من الخلايا الليفية 3T3.
اسمح للخلايا بالزراعة المشتركة والتوسع في وسائط التمدد لمدة 7 إلى 14 يوما. إذا تم إدخال المضادات الحيوية للخلايا المشتقة من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي ، فيجب استبدال الوسائط بوسائط توسع خالية من المضادات الحيوية بعد الأيام الثلاثة الأولى من الثقافة ، ويمكن أن تستمر في تغيير الوسائط كل يومين حتى تلتقي بنسبة 80٪. اغسل الخلايا باستخدام 1x DPBS.
ثم ، أضف 1.5 ملليلتر من 0.05٪ من التربسين-EDTA إلى قارورة T75 واحتضنها لمدة أربع دقائق عند 37 درجة مئوية لإزالة الخلايا الليفية 3T3 المشععة والمعطلة من الثقافة. شطف قارورة T75 مع 1x DPBS مرتين لغسل أي الخلايا الليفية المتبقية 3T3 تماما. أضف 1.5 ملليلتر من 0.05٪ من التربسين-EDTA إلى قارورة T75 واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل HNEs.
تحييد التربسين مع مثبط التربسين فول الصويا بنسبة واحد إلى واحد. الطرد المركزي للخلايا في 500 مرات gi لمدة خمس دقائق. ثم ، تخلص من supernatant واغسل الخلايا بخمسة ملليلترات من وسائط التمدد مرة واحدة.
الخلايا جاهزة الآن للبذر لزراعة المواد العضوية. قم بإذابة مصفوفة الثقافة العضوية خارج الخلية أو ECM بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. قم بتبريد شرائح تكوين الأوعية الدموية المكونة من 15 بئرا بين عشية وضحاها في نفس درجة الحرارة.
بعد ذلك ، قم بتبريد أطراف الماصة إلى أربع درجات مئوية. قم بتغطية الشرائح بخمسة ميكرولترات من ECM البارد بنسبة 100٪ على الجليد. ضعها في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للتوحيد.
عد HNEs التي تم حصادها من الزراعة المشتركة باستخدام مقياس الدم. ثم ، قم بتخفيف الخلايا إلى 500 خلية لكل ميكرولتر في العدد الإجمالي ، مع تخفيف 20٪ ECM بواسطة وسائط التمايز على الجليد. أخرج الشرائح المطلية ب ECM من الحاضنة وزرع خمسة ميكرولترات من خليط ECM للخلايا الباردة في كل بئر من الآبار.
انقل الشرائح على الفور إلى حاضنة استزراع عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة لدمج خليط ECM الخلوي. بعد ذلك ، أخرج الشرائح من الحاضنة وقم بتغذية الخلايا في كل بئر من شرائح تولد الأوعية المكونة من 15 بئرا مع 50 ميكرولتر من وسائط التمايز. أعد الشريحة إلى حاضنة الاستزراع عند 37 درجة مئوية ، مع تغيير الوسائط كل يومين حتى تصبح المواد العضوية جاهزة لمزيد من التجارب.
عالج مسبقا شرائح الغرفة ذات القاع الزجاجي المكون من 8 آبار بمادة لاصقة للخلية لمدة 30 دقيقة. تخلص من المحلول وجفف الآبار في الهواء لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، تخلص من الوسائط من أعلى ECM ثم أضف 50 ميكرولتر من PBS 1x البارد في كل بئر من شرائح 15 بئرا على الجليد.
ماصة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات باستخدام 200 ميكرولتر من طرف ماصة التجويف الكبير. قم بتوزيع المحلول على وسط بئر من شرائح الغرفة المكونة من 8 آبار. قم بإزالة السائل الزائد على الفور من الآبار بواسطة ماصة ذات طرف رفيع.
ثم ، ضع شريحة الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتعزيز التصاق العضوي بالقاع الزجاجي. بعد 40 دقيقة ، اغسل المواد العضوية بلطف باستخدام 1x PBS مرتين وقم بإصلاحها ب 300 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في كل بئر لمدة 30 دقيقة ضبط درجة حرارة الغرفة. يغسل مرتين مع 1x PBS وتخزين المواد العضوية في 1x PBS تعيين أربع درجات مئوية للتلطيخ المناعي لمدة تصل إلى أسبوعين.
لحصاد المواد العضوية للدراسات النسيجية ، قم بإزالة الوسائط من الثقافة وإضافة 50 ميكرولتر من PBS 1x البارد في كل بئر من الشرائح على الجليد. ماصة لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات باستخدام طرف ماصة كبير التجويف سعة 200 ميكرولتر. اجمع بين جميع الحلول من الشريحة أو البئر المكونة من 15 بئرا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر على الجليد.
اضبط إجمالي حجم المحلول في الأنبوب إلى 10 ملليلتر عن طريق إضافة 1x PBS بارد. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند أربع درجات مئوية ، 300 مرة غرام لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بسحب السوبر ناتانت وإضافة 60 ميكرولتر من الهيستوجيل الدافئ لمزجه مع الكريات العضوية باستخدام طرف ماصة كبير التجويف سعة 200 ميكرولتر.
نقل التعليق على الفور إلى قالب الأنسجة. بعد دمج الهيستوجيل في درجة حرارة الغرفة ، ضع كتلة القالب في 4٪ paraformaldehyde للتثبيت بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. افتح البرنامج وانقر بزر الماوس الأيمن في أسفل الشاشة.
بعد ذلك، حدد عناصر التحكم في التحليل، متبوعا بنتائج القياس التلقائي. افتح الصورة العضوية وحدد 5 إلى 10 عضويات ذات شمعة مرئية. اضغط بزر الماوس الأيمن على الصورة لفتح القائمة وحدد عائد استثمار مضلع لتحديد الجزء العضوي الكامل للحصول على المساحة الإجمالية لسطح العضوي.
ثم حدد التجويف للحصول على منطقة التجويف. كرر هذا بالنسبة للعضويات المتبقية في البئر ، وجميع الآبار في الفحص. وأخيرا، قم بتصدير البيانات إلى Excel.
اقسم مساحة التجويف على إجمالي مساحة السطح ومتوسط جميع المواد العضوية من العينة للحصول على نسبة التجويف الأساسية. تمثل الصور الميدانية الساطعة HNEs من مجموعة عينات ناجحة وغير ناجحة. تنمو HNEs بشكل جيد في مجموعة كبيرة.
في المقابل ، تنمو HNEs بشكل سيئ في مجموعتين صغيرتين تحيط بخلايا 3T3 المشععة. تحتوي المواد العضوية في الشريحة المكونة من 15 بئرا على صور أكثر دقة ووضوحا من تلك الموجودة في إدراج الثقافة. إلى جانب ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف مورفولوجي كبير في هاتين الطريقتين الثقافيتين.
عادة ما تحتوي المواد العضوية غير CF على تجويف أكبر وأكثر سوائل من المواد العضوية CF. تظهر في هذه الصور تلطيخ HNE في المواد العضوية من موضوع غير CF ، F508del / F508del ، وتلطيخ الفلورسنت المناعي للأهداب في عضوي. يتم عرض الأهداب الملطخة بالأسيتيلاتيد توبولين ، والأجسام المضادة الثانوية المسماة FITC ، والنوى الملصقة ب DAPI هنا.
يتم عرض صور الإسقاط القصوى للعضويتين التمثيليتين عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي الكامل وصور إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد المقابلة لهما هنا. يظهر المخاط والأهداب داخل تجويف المواد العضوية. تمثل الصور الرسومية فحص التورم الناجم عن الفورسكولين لاختبار وظيفة CFTR على الخلايا الظهارية الأنفية الأولية.
تظهر هنا تجربة استجابة جرعة فورسكولين تمثيلية للمتطوعين غير المصابين بالتليف الكيسي. تتم مقارنة استجابة جرعة FSK مع متوسط التغير الجزئي في ساعة واحدة ، مقابل ثماني ساعات ، مما يشير إلى أن فحص الساعات الثماني يمكن أن ينتج فرقا في التورم أكثر أهمية بين جرعات FSK المختلفة من تلك الموجودة في ساعة واحدة. يمكن أن تظهر المنطقة تحت المنحنى اختلافا طفيفا في التورم مقارنة بمتوسط التغير الجزئي في ثماني ساعات.
أثناء محاولة هذا الإجراء ، ضع في اعتبارك أنه سيتم فقدان المواد العضوية أثناء عملية الجمع والتثبيت والتلطيخ. لذلك ، يجب توخي الحذر الشديد خلال كل خطوة ويجب الحصول على أرقام بداية كافية لضمان النجاح. يمكن أن تساعد زراعة المواد العضوية في إدراج الثقافة في هذا الصدد ، حيث يتم تطوير هذه التقنيات.
وهنا، استخدمنا الكواشف والإمدادات المتاحة تجاريا لتسهيل التوسع ليشمل محققين آخرين. كما تم تطوير فحص وظيفي يستخدم تقنيات المجهر الشائعة والمعدات الأكثر تخصصا.
