يحدد هذا البروتوكول جيل جهاز المناعة البشري ، أو فئران HIS لدراسات الأورام المناعية قبل السريرية. نماذج سرطان الفئران محدودة في تنوعها وتترجم بشكل سيئ إلى العيادة. تعمل هذه التقنية كنموذج قبل السريري لدراسات العلاج المناعي من خلال تقييم علاج الأورام البشرية في فأر لديه جهاز مناعة بشري.
يمكن استخدام نموذج الفأر المتوافق مع البشر لدراسة جوانب متعددة من علم المناعة البشرية ، بما في ذلك الاستجابات للعديد من الإصابات ، أو سرطانات جهاز المناعة البشري. قد يكون الحصول على مصدر موثوق وقوي لدم الحبل السري والحفاظ على صحة مستعمرة الفئران التي تعاني من نقص المناعة أمرا صعبا. الخبرة في قياس التدفق الخلوي والتحليل المناعي ضرورية.
ستوضح كريستينا لارسن الإجراء ، وهي متخصصة في خدمات الأبحاث من مختبري. للبدء ، أعد تعليق حبيبات الخلايا الموجبة CD34 المعزولة من دم الحبل السري في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل واحد في 10 إلى الخلايا الثامنة. أضف 100 ميكرولتر من كاشف حجب FCR لكل واحد في 10 إلى الخلايا الثامنة ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي الإيجابي CD34 لكل واحد في 10 إلى الخلايا الثامنة ، واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلترات من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية لكل واحد في 10 إلى الخلايا الثامنة ، وقم بتدويره عند 360 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات سلزية. كرر خطوة الغسيل وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر لكل 100 مليون خلية من المخزن المؤقت لفاصل الخلايا المغناطيسية في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مكتوب عليه غير مجزأ. قم بتسمية أنبوبين آخرين سعة 15 ملليلتر CD34 سلبي و CD34 إيجابي ضع الأنابيب الثلاثة على رف التبريد.
افصل الخلايا باستخدام برنامج الاختيار الإيجابي المكون من عمودين على فاصل الخلايا المغناطيسية التلقائي في خزانة السلامة البيولوجية. بعد ذلك ، لتوسيع وتجميد الخلايا الجذعية البشرية الإيجابية CD34 ، قم بإعداد دم الحبل السري ، أو وسط CB كما هو موضح في المخطوطة ، وقم بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرون. أعد تعليق الخلايا الإيجابية CD34 عند 100،000 لكل مليلتر من وسط CB ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية.
في اليوم الثالث ، أضف حجما متساويا من وسط CB بدون السيتوكينات إلى القارورة. في اليوم الخامس ، احصد الخلايا الإيجابية CD34 الموسعة. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا ، وجمع في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
أضف ما يكفي من وسط CB لتغطية الجزء السفلي من القارورة. باستخدام مكشطة الخلية ، كشط الجزء السفلي بأكمله من القارورة. جمع كل الوسائط في نفس أنبوب 50 ملليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي.
إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر من وسط CB ، وأجهزة الطرد المركزي. نضح الوسط وصولا إلى الحبيبة ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط تجميد. بعد ذلك ، ابدأ إعداد الخلايا الإيجابية CD34 بعد ثلاث ساعات من تشعيع الجرو.
قم بتسخين 10 ملليلتر من وسائط CB في أنبوب سعة 50 ملليلتر. استرجع قارورة واحدة من الخلايا الإيجابية CD34 الموسعة والمجمدة في المختبر لكل أربعة إلى ستة جراء لحقنها. قم بإذابة الجليد بسرعة عند 50 إلى 55 درجة مئوية حتى تظهر كمية صغيرة من الجليد ، وأضف الخلايا إلى وسط CB الدافئ.
استخدم ملليلترا واحدا من الوسط لشطف كل قارورة ، وقم بتدوير الخلايا عند 360 جم لمدة 12 دقيقة عند أربع درجات مئوية. نضح الوسط بعناية. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من وسائط CB وعد الخلايا.
مرة أخرى ، قم بطرد الخلايا ، ونضح الوسط ، وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS المعقم لكل n بالإضافة إلى جرو واحد للحقن ، مما ينتج عنه 250،000 إلى 450،000 خلية إيجابية CD34 لكل فأر. لعزل PBMC من دم الفأر ، امزج الهيبارين الدموي عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل ، وقم بالتراكب ببطء فوق 500 ميكرولتر من 1.077 جرام لكل تدرج كثافة ملليلتر مع الحرص على عدم إزعاج الواجهة. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 1،220 جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون فواصل.
قم بإزالة أكبر عدد ممكن من الخلايا من معطف بافي باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، وأضفها إلى الأنبوب الجديد سعة 1.5 ملليلتر الذي يحتوي على 750 ميكرولتر من وسط الحصاد. أجهزة الطرد المركزي في 360 غرام لمدة 11 دقيقة. نضح الوسط إلى 50 ميكرولتر ، وأعد تعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من وسط الحصاد.
احصل على بيانات 100 ميكرولتر من كل عينة على مقياس التدفق الخلوي. ثم قم باستيراد ملف fcs إلى برنامج تحرير بيانات التدفق ، وقم بتطبيق بوابة مضلعة على مخطط FSC-A مقابل SSC-A. قم بتغيير المحاور إلى FSC-A مقابل FSC-H ، وقم ببوابة الخلايا على القطر الخطي ، باستثناء الثنائيات التي تبرز من الخط.
حدد هذه الخلايا وقم بتغيير المحاور إلى hCD45 مقابل mCD45. قم بتطبيق بوابة مضلعة على السكان المصابين ب hCD45 ، وقم بتطبيق اسم الإنسان. قم بتطبيق بوابة مضلع على السكان الموجب mCD45 ، وقم بتطبيق اسم الماوس.
إنشاء إحصائية عد للسكان من البشر والفئران. بعد ذلك ، حدد عدد السكان ، وقم بتغيير المحاور إلى CD19 مقابل CD3. ضع بوابة مضلعة على الخلايا الموجبة CD19 ، وقم بتسميتها الخلايا البائية.
ضع بوابة مضلعة على المجتمع الإحصائي الإيجابي CD3 ، وقم بتسميته الخلايا التائية. ثم قم بتطبيق بوابة مضلعة على السكان السالبين المزدوجين ، وقم بتسميتها غير السل. حدد محتوى الخلايا التائية وقم بتغيير المحاور إلى CD4 مقابل CD3.
ضع بوابة مضلعة على المجتمع الإحصائي الموجب CD4 ، وقم بتسميته CD4 إيجابيا. ضع بوابة مضلعة على المحتوى السالب CD4 ، وقم بتسميته CD8. حدد السكان غير المصابين بالسل ، وقم بتغيير المحاور إلى CD56 مقابل النخاعي.
قم بتطبيق بوابة مضلعة على إجمالي السكان الموجب CD56 ، وقم بتسميتها خلايا NK. ثم ضع بوابة مضلعة على السكان السالبين CD56 والإيجابي النقوي ، وقم بتسميتها النخاعية. أنشئ جدولا لإحصائيات النسبة المئوية والعدد لجميع السكان، وقم بتصديره إلى جدول بيانات.
احسب النسبة المئوية hCD45 الخيمرية باستخدام الصيغة المشار إليها. بعد نمو الخلايا السرطانية في الفأر وإدارة العلاجات الدوائية ، احصد الأنسجة. ضع الماوس على لوح تشريح رغوي مع دبابيس لتثبيتها في مكانها وتمديد الذراعين والساقين عند 45 درجة.
قم بعمل شق في منتصف الجذع يبدأ بالقرب من الحوض ويمتد إلى الذقن. اسحب الجلد إلى الحافة ، وثبته في مكانه باستخدام المسامير. استخراج الغدد الليمفاوية باستخدام ملقط دقيق بالترتيب الإبطي وعنق الرحم والمساريقي والأربي والحجاب الحاجز.
ضع الغدد الليمفاوية على جانب واحد من الشريحة الزجاجية المصنفرة في طبق بتري في ثمانية ملليلتر من وسط الحصاد. أمسك الشرائح بزوايا متعامدة مع الحواف المتجمدة إلى الداخل ، واضغط برفق على الأنسجة حتى يتم تحرير المحتويات الخلوية. اشطف الشريحة عدة مرات عن طريق فصلها عن بعضها البعض ومعا لتحرير أكبر عدد ممكن من الخلايا.
اجمع الخلايا باستخدام ماصة زجاجية مقاس 5 بوصات ، وقم بترشيحها من خلال ماصة موصولة بالقطن مقاس تسع بوصات في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. بعد ذلك ، استخرج الورم من الجناح المفتوح عن طريق إمساك الورم بالملقط أثناء القص ببطء عند حواف الورم بمقص التشريح. وزن الورم وإزالة 1/4 من الورم لمعالجة الحمض النووي الريبي والكيمياء المناعية.
ضع 3/4 المتبقية من الورم في طبق طوله ستة سنتيمترات ، وقم بفرمه إلى قطع ملليمتر واحد باستخدام شفرة مشرط. نقل قطع الورم إلى أنبوب التفكك. ثم شطف الطبق مع وسيط TIL غير مكتمل ، وإضافته إلى الأنبوب.
أضف مستحضر كولاجيناز ، وافصل الأنسجة باستخدام التفكك الميكانيكي عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة. مرر التعليق فوق مرشح 100 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر واشطف المرشح ب 10 ملليلتر من وسائط TIL الكاملة. أجهزة الطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في وسط حصاد كاف باستخدام DNase ، بحيث يمكن لتعليق الخلايا المرور بسهولة عبر طرف ماصة P1000 وتسجيل الحجم لتحليل المصب.
في PDX CRC 307P ، أدى العلاج المركب إلى إبطاء نمو الورم ، كما هو محدد من خلال أحجام نمو الورم بمرور الوقت ، وأوزان الورم ، ومعدل النمو المحدد. كان اختبار PDX CRC 307M في مجموعة مختلفة من الفئران أقل تأثرا بنفس العلاج المركب في فئران HIS BRGS. استنادا إلى الخيمرية البشرية الإيجابية hCD45 والإيجابية للخلايا التائية البشرية hCD3 في الدم قبل زرع الورم ، زادت كلتا المعلمتين في جهاز المناعة المحيطي و TIL بالاشتراك مع الفئران الحاملة ل CRC 307P المعالجة ، ولكن ليس نموذج CRC 307M.
كشف التحقيق في الخلايا التائية البشرية عن المزيد من الخلايا التائية المنشطة في أورام CRC 307P ، ولكن ليس الليمفاوية من الفئران المعالجة المركبة. أيضا ، كان هناك المزيد من الخلايا التائية الإيجابية CD8 للذاكرة المستجيبة وعدد أقل من الخلايا التائية الإيجابية TIM-3 في تركيبة أورام CRC 307P المعالجة. في المقابل ، لم يلاحظ هذا الاختلاف في نموذج CRC 307M.
علاوة على ذلك ، لم تلاحظ أي تغييرات في ترددات مجموعات الخلايا التائية السامة للخلايا بين الفئران المعالجة المركبة ، على الرغم من ملاحظة ارتفاع الخلايا التائية السامة للخلايا في الفئران غير المعالجة. لم يؤثر العلاج المركب على ترددات Tregs في الأعضاء الليمفاوية CRC 307P ، أو الأورام ، على الرغم من أن بيانات CRC 307M أظهرت اتجاها لانخفاض Tregs. تم رفع التغيرات المرتبطة بالمناعة في الخلايا السرطانية باستخدام قياس التدفق الخلوي.
لوحظ زيادة التعبير عن MHC من الفئة الأولى والفئة الثانية على الخلايا السرطانية CRC 307P التي تم استئصالها من فئران HIS BRGS المعالجة مجتمعة. في نموذج CRC 307M ، تسبب نفس العلاج الدوائي في تعبير HLA من الدرجة الثانية على الخلايا السرطانية. وبالمثل ، أدى العلاج المركب إلى زيادة تعبير PD-L1 على الخلايا السرطانية CRC 307P الإيجابية ل EpCAM.
أخيرا ، تم التحقيق في ارتباطات الاستجابات المناعية مع نمو الورم. أظهرت زيادة الخلايا التائية الإيجابية CD4 ارتباطا كبيرا بنمو الورم الأصغر ، وبشكل أكثر تحديدا الخلايا التائية المنشطة الإيجابية HLA-DR في المجموعة التي عولجت الفئران HIS. تقنية معقمة أثناء عزل الخلايا الإيجابية CD34 ، حيث أن الفئران تعاني من نقص المناعة الشديد.
الخيمرية الناتجة متغيرة داخل وبين المتبرعين بدم الحبل السري ، والخلايا التائية لها أكبر اختلاف. يمكن إجراء مجموعات غير محدودة من العلاج المناعي ، بالإضافة إلى الدراسات الحركية للجرعات الميكانيكية والدوائية ، على سبيل المثال ، حذف الخلايا التائية CD8 لتأكيد دورها. الأهم من ذلك ، يمكن أيضا دراسة السمية المتعلقة بالمخدرات.
لقد قدم نموذجا قبل سريريا أكثر صلة ويمكن الوصول إليه لاختبار العلاجات المناعية البشرية لترجمتها إلى العيادة. العديد من التجارب السريرية جارية الآن بناء على هذه البيانات.
