이 프로토콜은 전임상 면역 종양학 연구를 위한 인간 면역 체계 또는 HIS 마우스의 생성을 간략하게 설명합니다. 마우스 암 모델은 다양성이 제한되어 있으며 클리닉으로 잘 번역되지 않습니다. 이 기술은 인간 면역 체계를 가진 마우스에서 인간 종양의 치료를 평가함으로써 면역 요법 연구를 위한 전임상 모델 역할을 합니다.
인간화 마우스 모델은 많은 감염 또는 인간 면역계의 암에 대한 반응을 포함하여 인간 면역학의 여러 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있고 강력한 제대혈 공급원을 확보하고 면역결핍 마우스 군집의 건강을 유지하는 것은 어려울 수 있습니다. 유세포 분석 및 면역학적 분석에 대한 전문 지식이 필수적입니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 서비스 전문가 인 Kristina Larsen이 될 것입니다. 시작하여, 제대혈로부터 분리된 CD34 양성 세포 펠렛을 300 마이크로리터의 자기 세포 분리막 완충액에 1회 10 내지 8번째 세포에 재현탁시킨다. 여덟 번째 세포에 1 회 10 회 당 100 마이크로 리터의 FCR 차단 시약을 첨가 한 다음, 제 8 세포에 1 회 10 회 당 100 마이크로 리터의 CD34 양성 자기 비드를 첨가하고, 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양한다.
다음으로, 여덟 번째 셀에 1 회 10 당 5 밀리리터의 자기 세포 분리기 버퍼를 추가하고, 섭씨 4도에서 10 분 동안 360g에서 회전시킨다. 세척 단계를 반복하고 미분획으로 표지된 15밀리리터 원뿔형 튜브에 자기 세포 분리기 버퍼 1억 셀당 500마이크로리터의 펠릿을 재현탁합니다. 15밀리리터 튜브 2개 더 CD34 음성 및 CD34 양성 레이블 지정 3개의 튜브를 냉각 랙에 놓습니다.
생물 안전 캐비닛의 자동 자기 세포 분리기에서 2 컬럼 양성 선택 프로그램을 사용하여 세포를 분리합니다. 다음에, CD34 양성 인간 줄기세포를 확장 및 동결시키기 위해, 원고에 기재된 바와 같이 제대혈 또는 CB 배지를 준비하고, 0.22 미크론 필터를 통과시킨다. CD34 양성 세포를 CB 배지 밀리리터 당 100, 000에서 재현탁하고 섭씨 37도에서 배양합니다.
3일째에, 사이토카인이 없는 동일한 부피의 CB 배지를 플라스크에 첨가한다. 5일째에 확장된 CD34 양성 세포를 채취합니다. 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅하고 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 수집합니다.
플라스크 바닥을 덮을 수 있도록 충분한 CB 매체를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크의 바닥 전체를 긁어냅니다. 모든 매체를 동일한 50밀리리터 튜브에 수집하고 원심분리합니다.
세포를 2 밀리리터의 CB 배지에 재현탁하고, 원심 분리한다. 배지를 펠릿까지 흡인하고 펠릿을 동결 매체에 재현탁합니다. 다음으로, 강아지 방사선 조사 후 3 시간 후에 CD34 양성 세포 준비를 시작하십시오.
50 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 CB 매체를 따뜻하게합니다. 주사할 새끼 4-6마리마다 시험관 내 확장 및 냉동 CD34 양성 세포 바이알 1개를 회수합니다. 소량의 얼음이 보일 때까지 섭씨 50도에서 55도까지 빠르게 해동하고 세포를 데운 CB 배지에 첨가하십시오.
1 밀리리터의 배지를 사용하여 각 바이알을 헹구고 섭씨 4도에서 12 분 동안 360g에서 세포를 회전시킵니다. 매체를 조심스럽게 흡인하십시오. 펠릿을 2 밀리리터의 CB 배지에 재현 탁하고 세포를 계수합니다.
다시, 세포를 원심분리하고, 배지를 흡인하고, 펠릿을 n개당 100 마이크로리터의 멸균 PBS에 주입하기 위해 1마리의 새끼를 더한 상태로 재현탁하여, 마우스당 250, 000 내지 450, 000개의 CD34-양성 세포를 생성한다. 마우스 혈액에서 PBMC 분리를 위해 혈액 헤파린을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 계면을 방해하지 않도록 주의하면서 밀리리터당 1.077g의 밀도 구배 500마이크로리터 위에 천천히 오버레이합니다. 튜브를 1, 220g에서 실온에서 20분 동안 쉬지 않고 원심분리합니다.
200 마이크로 리터 피펫으로 버피 코트에서 가능한 한 많은 세포를 제거하고 750 마이크로 리터의 수확 배지가 들어있는 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 360g에서 11분 동안 원심분리합니다. 배지를 50 마이크로리터로 흡인하고, 750 마이크로리터의 수확 배지에 펠릿을 재현탁시킨다.
유세포 분석기에서 각 샘플의 100마이크로리터에 대한 데이터를 수집합니다. 그런 다음 fcs 파일을 유동 데이터 편집 소프트웨어로 가져오고 FSC-A 대 SSC-A 플롯에 폴리곤 게이트를 적용합니다. 축을 FSC-A 대 FSC-H로 변경하고 선에서 돌출된 이중선을 제외하고 선형 대각선의 셀을 게이트합니다.
이 셀을 선택하고 축을 hCD45 대 mCD45로 변경합니다. hCD45 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 human이라는 이름을 적용합니다. mCD45 양성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 mouse라는 이름을 적용합니다.
인간 및 마우스 개체군에 대한 계수 통계를 만듭니다. 다음으로, 인간 모집단을 선택하고 축을 CD19 대 CD3로 변경합니다. CD19 양성 세포에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 B 세포로 지정합니다.
CD3 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 T-세포로 지정합니다. 그런 다음 이중 음수 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 non-TB로 지정합니다. T 세포 집단을 선택하고 축을 CD4 대 CD3로 변경합니다.
CD4 양성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 CD4 양성으로 지정합니다. CD4 음성 모집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 CD8로 지정합니다. TB가 아닌 모집단을 선택하고 축을 CD56 대 골수로 변경합니다.
전체 CD56 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 NK 세포로 지정합니다. 그런 다음 CD56 음성 및 골수 양성 집단에 다각형 게이트를 적용하고 이름을 myeloid로 지정합니다. 모든 모집단의 백분율 및 개수 통계에 대한 표를 만들고 스프레드시트로 내보냅니다.
표시된 공식을 사용하여 hCD45 키메라 비율을 계산하십시오. 마우스에서 종양 세포를 성장시키고 약물 치료를 한 후 조직을 수확합니다. 마우스를 핀이 있는 폼 해부 보드에 올려 제자리에 고정하고 팔과 다리를 45도로 뻗습니다.
골반 근처에서 시작하여 턱까지 뻗어 있는 몸통 중앙을 절개합니다. 피부를 가장자리로 당기고 핀으로 제자리에 고정하십시오. 미세 집게를 사용하여 겨드랑이, 자궁경부, 장간막, 사타구니, 열공 순으로 림프절을 추출합니다.
젖빛 유리 슬라이드의 한쪽면에 림프절을 8 밀리리터의 수확 배지에 페트리 접시에 놓습니다. 서리로 덥은 가장자리가 안쪽으로 향하도록 슬라이드를 수직 각도로 잡고 세포 내용물이 방출 될 때까지 조직을 부드럽게 누릅니다. 슬라이드를 떼어내고 함께 당겨 여러 번 헹구어 최대 수의 셀을 분리합니다.
5인치 유리 피펫으로 세포를 수집하고 9인치 면 플러그 피펫을 통해 라벨이 붙은 15밀리리터 원뿔형 튜브로 여과합니다. 다음으로, 집게로 종양을 잡고 해부 가위로 종양 가장자리를 천천히 잘라내어 열린 옆구리에서 종양을 추출합니다. 종양의 무게를 측정하고 RNA 및 면역조직화학 처리를 위해 종양의 1/4을 제거합니다.
종양의 나머지 3/4을 6 센티미터 접시에 넣고 메스 블레이드를 사용하여 1 밀리미터 조각으로 다진다. 종양 조각을 해리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 불완전한 TIL 매체로 접시를 헹구고 튜브에 넣으십시오.
콜라게나제 제제를 첨가하고, 섭씨 37도에서 30분 내지 1시간 동안 기계적 해리를 이용하여 조직을 해리시킨다. 100미크론 필터 위의 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 통과시키고 10밀리리터의 TIL 완전 매체로 필터를 헹굽니다. DNase를 사용하여 충분한 수확 배지에서 펠릿을 원심분리하고 재현탁하여 세포 현탁액이 P1000 피펫 팁을 쉽게 통과하고 다운스트림 분석을 위해 부피를 기록할 수 있도록 합니다.
PDX CRC 307P에서, 병용 처리는 시간 경과에 따른 종양 성장 부피, 종양 중량 및 특이적 성장 속도에 의해 결정된 바와 같이, 종양의 성장을 늦췄다. 상이한 마우스 코호트에서 시험된 PDX CRC 307M은 HIS BRGS 마우스에서 동일한 조합 처리에 의해 덜 영향을 받았다. 종양 이식 전 혈액에서 전체 인간 hCD45 양성 및 인간 T 세포 hCD3 양성 키메라에 기초하여, 두 매개변수 모두 처리된 CRC 307P-함유 마우스와 조합하여 말초 면역계 및 TIL에서 증가했지만, CRC 307M 모델은 증가하지 않았다.
인간 T 세포에 대한 조사는 CRC 307P 종양에서 더 많은 활성화된 T 세포를 밝혀냈지만 병용 처리된 마우스의 림프는 나타내지 않았습니다. 또한, 조합 처리된 CRC 307P 종양에서 더 많은 이펙터 기억 CD8 양성 T 세포와 더 적은 TIM-3 양성 T 세포가 있었다. 대조적으로, 이 차이는 CRC 307M 모델에서는 언급되지 않았다.
또한, 병용 처리된 마우스에서는 세포독성 T 세포 집단의 빈도 변화가 관찰되지 않았지만, 처리되지 않은 마우스에서는 더 높은 세포독성 T 세포가 관찰되었습니다. 병용 치료는 CRC 307P 림프 기관 또는 종양에서 Treg의 빈도에 영향을 미치지 않았지만, CRC 307M 데이터는 Treg가 감소하는 경향을 보였다. 종양 세포의 면역 관련 변화는 유세포 분석을 사용하여 상승되었습니다.
MHC 클래스 I 및 클래스 II의 증가된 발현이 조합 처리된 HIS BRGS 마우스로부터 절제된 CRC 307P 종양 세포 상에서 관찰되었다. CRC 307M 모델에서, 동일한 약물 처리가 종양 세포 상에서 HLA 클래스 II 발현을 유도하였다. 유사하게, 병용 처리는 EpCAM-양성 CRC 307P 종양 세포 상에서 증가된 PD-L1 발현을 초래하였다.
마지막으로, 면역 반응과 종양 성장의 상관 관계를 조사했습니다. 증가된 CD4-양성 T-세포는 더 작은 종양 성장, 보다 구체적으로는 조합 처리된 HIS 마우스에서 HLA-DR-양성 활성화된 T-세포와 유의한 상관관계를 나타내었다. CD34 양성 세포를 단리하면서 멸균 기술, 마우스는 극도로 면역 결핍되어 있습니다.
결과적인 키메라즘은 제대혈 기증자 내에서 그리고 제대혈 기증자 사이에서 가변적이며 T 세포는 가장 큰 변이를 가지고 있습니다. 무제한 면역 요법 조합뿐만 아니라 기계 론적 및 약물 투여 동역학 연구, 예를 들어 CD8 T 세포의 결실을 수행하여 그 역할을 확인할 수 있습니다. 중요한 것은 약물 관련 독성도 연구 할 수 있다는 것입니다.
그것은 임상으로의 번역을 위해 인간 면역 요법을 테스트하기 위해 보다 관련성이 높고 접근 가능한 전임상 모델을 제공했습니다. 이러한 데이터를 기반으로 현재 여러 임상 시험이 진행 중입니다.
