このプロトコルは、前臨床免疫腫瘍学研究のためのヒト免疫系またはHISマウスの生成について概説しています。マウスがんモデルは多様性が限られており、臨床への変換が不十分です。この技術は、ヒト免疫系を有するマウスにおけるヒト腫瘍の治療を評価することにより、免疫療法研究の前臨床モデルとして役立つ。
ヒト化マウスモデルは、多くの感染症やヒト免疫系の癌に対する反応など、ヒト免疫学の複数の側面を研究するために使用できます。信頼性が高く堅牢な臍帯血源を獲得し、免疫不全マウスコロニーの健康を維持することは困難な場合があります。フローサイトメトリーと免疫学的分析の専門知識が不可欠です。
手順を実演するのは、私の研究室の研究サービスの専門家であるクリスティーナラーセンです。はじめに、臍帯血から単離したCD34陽性細胞ペレットを10〜8番目の細胞につき1回あたり300マイクロリットルの磁気細胞分離緩衝液に再懸濁する。8番目の細胞に10回あたり100マイクロリットルのFCRブロッキング試薬を加え、続いて10〜8番目の細胞に1回あたり100マイクロリットルのCD34陽性磁気ビーズを加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。
次に、8番目のセルに10回あたり5ミリリットルの磁気セルセパレータバッファーを加え、摂氏4度で360gで10分間回転させる。洗浄工程を繰り返し、未分画とラベル付けされた15ミリリットルの円錐管に1億セル当たり500マイクロリットルの磁気セル分離バッファーにペレットを再懸濁する。さらに2本の15ミリリットルチューブにラベルを付けます CD34陰性およびCD34陽性 3本のチューブを冷却ラックに置きます。
バイオセーフティキャビネット内の自動磁気セルセパレーター上の2列のポジティブ選択プログラムを使用して細胞を分離します。次に、CD34陽性ヒト幹細胞を増殖・凍結するために、原稿に記載されているように臍帯血またはCB培地を調製し、0.22ミクロンのフィルターを通過させる。CD34陽性細胞をCB培地1ミリリットルあたり100, 000で再懸濁し、摂氏37度でインキュベートします。
3日目に、サイトカインを含まない等量のCB培地をフラスコに加えます。5日目に、増殖したCD34陽性細胞を回収します。細胞懸濁液を上下にピペットで入れ、50ミリリットルの円錐管に集めます。
フラスコの底を覆うのに十分なCB培地を追加します。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底全体をこすります。すべての培地を同じ50ミリリットルのチューブに集め、遠心分離します。
細胞を2ミリリットルのCB培地に再懸濁し、遠心分離する。培地をペレットまで吸引し、ペレットを凍結培地に再懸濁する。次に、仔の照射から3時間後にCD34陽性細胞の調製を開始する。
50ミリリットルのチューブで10ミリリットルのCB培地を温めます。注入する4〜6匹の子犬ごとに、in vitroで増殖および凍結されたCD34陽性細胞のバイアルを1つ回収します。少量の氷が見えるまで摂氏50〜55度で急速に解凍し、温めたCB培地に細胞を加えます。
1ミリリットルの培地を使用して各バイアルをすすぎ、細胞を360 gで摂氏4度で12分間回転させます。培地を慎重に吸引します。ペレットを2ミリリットルのCB培地に再懸濁し、細胞をカウントします。
再度、細胞を遠心分離し、培地を吸引し、ペレットを100マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁し、1匹の子犬を加えた1匹を注入すると、マウスあたり250, 000〜450, 000個のCD34陽性細胞が得られます。マウスの血液からPBMCを単離するには、血液ヘパリンを穏やかに上下にピペッティングして混合し、界面を乱さないように注意しながら、1ミリリットルあたり1.077グラムの密度勾配を500マイクロリットルの上にゆっくりと重ねます。チューブを1, 220 gで室温で20分間遠心分離し、中断することなく遠心分離します。
200マイクロリットルのピペットでバフィーコートからできるだけ多くの細胞を取り除き、750マイクロリットルの収穫培地を含む新しい1.5ミリリットルのチューブに追加します。360gで11分間遠心分離する。培地を50マイクロリットルに吸引し、ペレットを750マイクロリットルの収穫培地に再懸濁します。
フローサイトメーターで各サンプル100マイクロリットルのデータを取得します。次に、fcsファイルをフローデータ編集ソフトウェアにインポートし、FSC-A対SSC-Aプロットにポリゴンゲートを適用します。軸をFSC-A対FSC-Hに変更し、線から突き出ているダブレットを除いて、直線対角線上のセルをゲートします。
これらの細胞を選択し、軸をhCD45対mCD45に変更します。hCD45陽性集団にポリゴンゲートを適用し、ヒトという名前を適用します。mCD45陽性集団にポリゴンゲートを適用し、マウスという名前を適用します。
ヒトとマウスの集団のカウント統計を作成します。次に、人口を選択し、軸をCD19対CD3に変更します。CD19陽性細胞にポリゴンゲートを適用し、B細胞という名前を付けます。
CD3陽性集団にポリゴンゲートを適用し、T細胞という名前を付けます。次に、二重負の母集団にポリゴン ゲートを適用し、非 TB という名前を付けます。T細胞集団を選択し、軸をCD4対CD3に変更します。
CD4陽性集団にポリゴンゲートを適用し、CD4陽性という名前を付けます。CD4陰性母集団にポリゴンゲートを適用し、CD8という名前を付けます。非結核集団を選択し、軸をCD56対骨髄に変更します。
CD56陽性集団全体にポリゴンゲートを適用し、NK細胞と名付けます。次に、CD56陰性および骨髄陽性集団にポリゴンゲートを適用し、骨髄性という名前を付けます。すべての母集団のパーセンテージとカウント統計量のテーブルを作成し、スプレッドシートにエクスポートします。
示された式を使用してhCD45キメラの割合を計算します。マウスで腫瘍細胞を増殖させ、薬物治療を行った後、組織を採取します。ピン付きのフォーム解剖板にマウスを置き、それらを所定の位置に保持し、腕と脚を45度に伸ばします。
骨盤の近くからあごまで伸びる胴体の中央を切開します。皮膚を端まで引っ張り、ピンで所定の位置に保持します。細鉗子を用いて、腋窩、頸部、腸間膜、鼠径部、裂孔の順にリンパ節を摘出します。
すりガラススライドの片側にリンパ節を8ミリリットルの収穫培地中のペトリ皿に入れます。つや消しの端を内側にしてスライドを垂直な角度で保持し、細胞内容物が放出されるまで組織を静かに押します。スライドを引き離して一緒に数回すすぎ、最大数のセルを解放します。
5インチのガラスピペットで細胞を収集し、9インチの綿プラグピペットを通してラベルの付いた15ミリリットルの円錐形のチューブにろ過します。次に、解剖ハサミで腫瘍縁をゆっくりと切り取りながら、鉗子で腫瘍を保持して、開いた脇腹から腫瘍を抽出します。腫瘍の重量を量り、RNAおよび免疫組織化学処理のために腫瘍の1/4を除去します。
腫瘍の残りの3/4を6センチメートルの皿に入れ、メスの刃を使って1ミリメートルの小片に細かく刻みます。腫瘍片を解離チューブに移します。次に、皿を不完全なTIL培地ですすぎ、チューブに追加します。
コラゲナーゼ調製物を添加し、摂氏37度で30分から1時間機械的解離を使用して組織を解離させる。懸濁液を100ミクロンのフィルターにかけ、50ミリリットルの円錐管に入れ、10ミリリットルのTIL完全培地ですすいでください。DNaseを含むちょうど十分な収穫培地にペレットを遠心分離して再懸濁すると、細胞懸濁液がP1000ピペットチップを簡単に通過し、下流分析のために容量を記録できます。
PDX CRC 307Pでは、併用治療は、経時的な腫瘍増殖量、腫瘍重量、および比増殖速度によって決定されるように、腫瘍の成長を遅らせた。マウスの異なるコホートで試験したPDX CRC 307Mは、HIS BRGSマウスにおける同じ併用治療による影響が少なかった。腫瘍移植前の血液中の全体的なヒトhCD45陽性およびヒトT細胞hCD3陽性キメラに基づくと、治療されたCRC 307P保有マウスと組み合わせた末梢免疫系およびTILの両方のパラメータが増加しましたが、CRC 307Mモデルは増加しませんでした。
ヒトT細胞の調査では、CRC 307P腫瘍でより多くの活性化T細胞が明らかになりましたが、併用治療マウスのリンパ液は見つかりませんでした。また、併用処理されたCRC 307P腫瘍では、より多くのエフェクターメモリーCD8陽性T細胞およびより少ないTIM-3陽性T細胞があった。対照的に、この違いはCRC 307Mモデルでは認められませんでした。
さらに、併用処理マウスの間では細胞傷害性T細胞集団の頻度に変化は観察されなかったが、未処置ではより高い細胞傷害性T細胞が観察された。併用治療は、CRC 307Pリンパ器官または腫瘍のいずれにおいてもTregの頻度に影響しなかったが、CRC 307MデータはTregsの減少傾向を示した。腫瘍細胞における免疫関連の変化は、フローサイトメトリーを用いて上昇した。
MHCクラスIおよびクラスIIの発現の増加は、併用処理されたHIS BRGSマウスから摘出したCRC 307P腫瘍細胞上で観察された。CRC 307Mモデルでは、同じ薬物治療が腫瘍細胞上でHLAクラスII発現を誘導した。同様に、併用治療は、EpCAM陽性CRC 307P腫瘍細胞上でのPD−L1発現の増加をもたらした。
最後に、免疫応答と腫瘍増殖との相関関係を調べた。CD4陽性T細胞の増加は、より小さな腫瘍増殖、より具体的には組み合わせ処理されたHISマウスにおけるHLA-DR陽性活性化T細胞と有意な相関を示した。CD34陽性細胞を単離しながらの滅菌技術は、マウスとしては極めて免疫不全である。
結果として生じるキメラは、臍帯血ドナー内および臍帯血ドナー間で変動し、T細胞が最も大きな変動を有する。無制限の免疫療法の組み合わせ、ならびに機構的および薬物投与動態学的研究、例えばそれらの役割を確認するためのCD8 T細胞の欠失を実施することができる。重要なことに、薬物関連の毒性も研究することができます。
これは、臨床への翻訳のためにヒト免疫療法をテストするための、より関連性が高くアクセスしやすい前臨床モデルを提供しました。これらのデータに基づいて、現在いくつかの臨床試験が進行中です。
