该协议概述了用于临床前免疫肿瘤学研究的人类免疫系统或HIS小鼠的产生。小鼠癌症模型的多样性有限，对临床的转化效果很差。该技术通过评估具有人类免疫系统的小鼠中人类肿瘤的治疗，作为免疫治疗研究的临床前模型。
人源化小鼠模型可用于研究人类免疫学的多个方面，包括对许多感染或人类免疫系统癌症的反应。获取可靠而强大的脐带血来源并维持免疫缺陷小鼠群体的健康可能具有挑战性。流式细胞术和免疫学分析方面的专业知识至关重要。
演示该程序的将是我实验室的研究服务专业人员克里斯蒂娜·拉森（Kristina Larsen）。首先，将从脐带血中分离的CD34阳性细胞沉淀重悬于300微升磁性细胞分离缓冲液中，每1次10次重悬至第八个细胞。向第八个细胞中每1次10加入100微升FCR封闭试剂，然后每1次10次向第八个细胞加入100微升CD34阳性磁珠，并在4摄氏度下孵育30分钟。
接下来，向第八个细胞中每10倍加入5毫升磁性细胞分离器缓冲液，并在4摄氏度下以360g旋转10分钟。重复洗涤步骤，并将沉淀重悬于每1亿个磁性细胞分离器缓冲液的500微升中，在标记未分级的15毫升锥形管中。再标记两个 15 毫升管 CD34 阴性和 CD34 阳性 将三个试管放在冷却架上。
使用生物安全柜中自动磁性细胞分离器上的两列正向选择程序分离细胞。接下来，为了扩增和冷冻CD34阳性的人干细胞，按照手稿中所述制备脐带血或CB培养基，并通过0.22微米的过滤器。将CD34阳性细胞重悬于每毫升CB培养基100， 000，并在37摄氏度下孵育。
在第三天，向烧瓶中加入等体积的不含细胞因子的CB培养基。在第五天，收获扩增的CD34阳性细胞。上下移液细胞悬液，并收集在50毫升锥形管中。
加入足够的CB培养基以覆盖烧瓶底部。使用细胞刮刀刮擦烧瓶的整个底部。将所有培养基收集到同一个50毫升管中，然后离心。
将细胞重悬于两毫升CB培养基中，然后离心。将培养基向下吸出到沉淀中，然后将沉淀重新悬浮在冷冻介质中。接下来，在幼崽照射后三小时开始CD34阳性细胞制备。
在50毫升的管中加热10毫升CB培养基。每四到六只幼崽注射一瓶体外扩增和冷冻的CD34阳性细胞。在50至55摄氏度下快速解冻，直到只看到少量冰，然后将细胞添加到加热的CB培养基中。
使用一毫升培养基冲洗每个小瓶，并在4摄氏度下以360g旋转细胞12分钟。小心吸出培养基。将沉淀重悬于两毫升CB培养基中并计数细胞。
再次，离心细胞，吸出培养基，并将沉淀重悬于每n加一个幼崽的100微升无菌PBS中，导致每只小鼠250， 000至450， 000个CD34阳性细胞。对于从小鼠血液中分离的PBMC，通过轻轻上下移液混合血液肝素，并缓慢覆盖在500微升1.077克/毫升密度梯度的顶部，注意不要干扰界面。在室温下以1， 220 g离心管20分钟，无间断。
用 200 微升移液管从血沉棕黄层中取出尽可能多的细胞，并添加到含有 750 微升收获培养基的新 1.5 毫升管中。以360克离心11分钟。将培养基吸出至50微升，并将沉淀重悬于750微升收获培养基中。
在流式细胞仪上获取每个样品100微升的数据。然后将 fcs 文件导入流数据编辑软件，并将多边形门应用于 FSC-A 与 SSC-A 图。将轴更改为 FSC-A 而不是 FSC-H，并在线性对角线上对单元格进行门控，不包括从线上突出的双峰。
选择这些细胞并将轴更改为 hCD45 而不是 mCD45。将多边形门应用于 hCD45 阳性群体，并应用名称 human。将多边形门应用于 mCD45 阳性群体，并应用名称鼠标。
为人类和小鼠种群创建计数统计量。接下来，选择人群，并将轴更改为CD19与CD3。将多边形门应用于CD19阳性细胞，并将其命名为B细胞。
对CD3阳性群体应用多边形门，并将其命名为T细胞。然后将多边形门应用于双重阴性总体，并将其命名为 non-TB。选择 T 细胞群并将轴更改为 CD4 与 CD3。
将多边形门应用于 CD4 阳性群体，并将其命名为 CD4 阳性。将多边形门应用于 CD4 阴性群体，并将其命名为 CD8。选择非结核病人群，并将轴更改为 CD56 与骨髓。
将多边形门应用于总CD56阳性群体，并将其命名为NK细胞。然后将多边形门应用于CD56阴性和髓系阳性群体，并将其命名为骨髓。为所有总体的百分比和计数统计数据创建一个表，并将其导出到电子表格。
使用指示的公式计算hCD45嵌合体的百分比。在小鼠中生长肿瘤细胞并给予药物治疗后，收获组织。将鼠标放在带有销钉的泡沫解剖板上以将其固定到位，并将手臂和腿伸展 45 度。
从骨盆附近开始，在躯干中间切开一个切口，一直延伸到下巴。将皮肤拉到边缘，并用别针将其固定到位。使用细镊子按腋窝、宫颈、肠系膜、腹股沟和食管裂孔顺序拔除淋巴结。
将淋巴结放在磨砂玻璃载玻片的一侧，在八毫升收获培养基中的培养皿中。以垂直角度握住载玻片，磨砂边缘向内，轻轻按压组织，直到释放细胞内容物。通过将载玻片拉开并一起冲洗载玻片几次，以释放最大数量的细胞。
用 5 英寸玻璃移液管收集细胞，并通过 9 英寸棉塞移液管将它们过滤到标记的 15 毫升锥形管中。接下来，用镊子握住肿瘤，同时用解剖剪刀缓慢剪断肿瘤边缘，从开放的侧翼提取肿瘤。称量肿瘤并去除 1/4 的肿瘤以进行 RNA 和免疫组织化学处理。
将剩余的 3/4 肿瘤放入 6 厘米的培养皿中，并使用手术刀刀片将其切成 1 毫米的碎片。将肿瘤碎片转移到解离管中。然后用不完整的TIL培养基冲洗培养皿，并将其添加到管中。
加入胶原酶制剂，并在37摄氏度下使用机械解离组织30分钟至1小时。将悬浮液通过 100 微米过滤器进入 50 毫升锥形管中，并用 10 毫升 TIL 完全培养基冲洗过滤器。将沉淀离心并重悬于含有DNase的足够收获培养基中，以便细胞悬液可以轻松通过P1000移液器吸头并记录体积以进行下游分析。
在PDX CRC 307P中，联合治疗减缓了肿瘤的生长，这取决于肿瘤随时间的生长体积，肿瘤重量和特定生长速率。在不同小鼠队列中测试的PDX CRC 307M受HIS BRGS小鼠相同组合治疗的影响较小。基于肿瘤植入前血液中人hCD45阳性和人T细胞hCD3阳性嵌合体的总体情况，与治疗的CRC 307P携带小鼠联合使用外周免疫系统和TIL中的两个参数都增加了，但CRC 307M模型没有。
对人类T细胞的研究显示，CRC 307P肿瘤中有更多的活化T细胞，但联合治疗小鼠的淋巴液没有。此外，在联合治疗的CRC 307P肿瘤中，有更多的效应记忆CD8阳性T细胞和更少的TIM-3阳性T细胞。相比之下，CRC 307M型号没有注意到这种差异。
此外，在联合治疗的小鼠中没有观察到细胞毒性T细胞群频率的变化，尽管在未治疗的小鼠中观察到更高的细胞毒性T细胞。联合治疗不影响CRC 307P淋巴器官或肿瘤中Tregs的频率，尽管CRC 307M数据显示Tregs有减少的趋势。使用流式细胞术提高肿瘤细胞的免疫相关变化。
在从组合处理的HIS BRGS小鼠切除的CRC 307P肿瘤细胞上观察到MHC I类和II类的表达增加。在CRC 307M模型中，相同的药物治疗诱导肿瘤细胞上的HLA II类表达。同样，联合治疗导致EpCAM阳性CRC 307P肿瘤细胞上的PD-L1表达增加。
最后，研究了免疫应答与肿瘤生长的相关性。增加的CD4阳性T细胞显示出与较小的肿瘤生长显着相关，更具体地说，联合治疗HIS小鼠的HLA-DR阳性活化T细胞。无菌技术同时分离CD34阳性细胞，因为小鼠免疫缺陷极强。
由此产生的嵌合在脐带血供体内部和之间是可变的，T细胞具有最大的变异。可以进行无限的免疫治疗组合，以及机制和药物给药动力学研究，例如，删除CD8 T细胞以确认其作用。重要的是，还可以研究与药物相关的毒性。
它提供了一个更相关和更易于访问的临床前模型来测试人类免疫疗法以转化为临床。基于这些数据，目前正在进行几项临床试验。
