Este protocolo describe la generación de ratones del Sistema Inmune Humano, o HIS, para estudios preclínicos de inmunooncología. Los modelos de cáncer de ratón son limitados en su diversidad y se traducen mal a la clínica. Esta técnica sirve como modelo preclínico para estudios de inmunoterapia mediante la evaluación del tratamiento de tumores humanos en un ratón con un sistema inmune humano.
El modelo de ratón humanizado se puede utilizar para estudiar múltiples aspectos de la inmunología humana, incluidas las respuestas a muchas infecciones o cánceres del sistema inmunológico humano. Adquirir una fuente confiable y robusta de sangre del cordón umbilical y mantener la salud de la colonia de ratones inmunodeficientes puede ser un desafío. La experiencia en citometría de flujo y análisis inmunológico es esencial.
Demostrando el procedimiento estará Kristina Larsen, una profesional de servicios de investigación de mi laboratorio. Para comenzar, resuspenda el pellet de células CD34 positivas aislado de la sangre del cordón umbilical en 300 microlitros de tampón separador de células magnéticas por una vez de 10 a octava celdas. Agregue 100 microlitros de reactivo bloqueador FCR por una vez 10 a la octava celda, seguido de 100 microlitros de perlas magnéticas CD34 positivas por una vez 10 a octavas células, e incube a cuatro grados Celsius durante 30 minutos.
A continuación, agregue cinco mililitros de tampón separador de células magnéticas por una vez 10 a la octava celda, y gire a 360 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Repita el paso de lavado y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros por cada 100 millones de células de tampón separador de células magnéticas en un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado sin fraccionar. Etiquete dos tubos más de 15 mililitros CD34-negativo y CD34-positivo Coloque los tres tubos en una rejilla de enfriamiento.
Separe las células utilizando el programa de selección positiva de dos columnas en un separador magnético automático de células en un gabinete de bioseguridad. A continuación, para expandir y congelar las células madre humanas CD34 positivas, prepare la sangre del cordón umbilical, o medio CB como se describe en el manuscrito, y pase a través de un filtro de 0,22 micras. Resuspender las células CD34 positivas a 100, 000 por mililitro de medio CB e incubar a 37 grados centígrados.
En el tercer día, añadir al matraz un volumen igual de medio CB sin citoquinas. En el quinto día, cosecha las células CD34 positivas expandidas. Pipetear la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo, y recoger en un tubo cónico de 50 mililitros.
Añadir suficiente CB medio para cubrir el fondo del matraz. Con un raspador de celdas, raspe todo el fondo del matraz. Recoja todos los medios en el mismo tubo de 50 mililitros y centrífugo.
Resuspender las células en dos mililitros de medio CB, y centrifugar. Aspire el medio hasta el pellet y vuelva a suspender el pellet en un medio de congelación. A continuación, comience la preparación de células CD34 positivas tres horas después de la irradiación del cachorro.
Caliente 10 mililitros de medios CB en un tubo de 50 mililitros. Recupere un vial de células CD34 positivas expandidas y congeladas in vitro por cada cuatro a seis cachorros para inyectar. Descongele rápidamente a 50 a 55 grados centígrados hasta que solo se vea una pequeña cantidad de hielo y agregue las células al medio CB calentado.
Use un mililitro de medio para enjuagar cada vial y gire las células a 360 g durante 12 minutos a cuatro grados centígrados. Aspire el medio con cuidado. Resuspender el pellet en dos mililitros de medios CB y contar las células.
Una vez más, centrifugar las células, aspirar el medio y resuspender el pellet en 100 microlitros de PBS estéril por n más un cachorro para inyectar, lo que resulta en 250, 000 a 450, 000 células CD34 positivas por ratón. Para el aislamiento de PBMC de sangre de ratón, mezcle la heparina sanguínea pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y superponga lentamente sobre 500 microlitros de gradiente de densidad de 1.077 gramos por mililitro, teniendo cuidado de no perturbar la interfaz. Centrifugar el tubo a 1, 220 g durante 20 minutos a temperatura ambiente sin interrupciones.
Retire tantas células como sea posible de la capa leucocitaria con una pipeta de 200 microlitros y agregue al nuevo tubo de 1,5 mililitros que contiene 750 microlitros de medio de cosecha. Centrifugar a 360 g durante 11 minutos. Aspirar el medio a 50 microlitros, y resuspender el pellet en 750 microlitros de medio de cosecha.
Adquiera los datos de 100 microlitros de cada muestra en un citómetro de flujo. A continuación, importe el archivo fcs al software de edición de datos de flujo y aplique una puerta de polígono a una gráfica FSC-A frente a SSC-A. Cambie los ejes a FSC-A frente a FSC-H, y compuerta las celdas en la diagonal lineal, excluyendo los dobletes que sobresalen de la línea.
Seleccione estas células y cambie los ejes a hCD45 frente a mCD45. Aplique una puerta de polígono a la población hCD45 positiva y aplique el nombre humano. Aplique una puerta de polígono a la población mCD45 positiva y aplique el nombre mouse.
Crear una estadística de conteo para poblaciones humanas y de ratones. A continuación, seleccione la población humana y cambie los ejes a CD19 frente a CD3. Aplique una puerta de polígono a las células CD19 positivas y asígneles el nombre de células B.
Aplique una puerta de polígono a la población CD3 positiva y asígnele el nombre de células T. Luego aplique una puerta de polígono a la población doble negativa y asígnele el nombre no TB. Seleccione la población de células T y cambie los ejes a CD4 versus CD3.
Aplique una puerta de polígono a la población CD4 positiva y asígnele el nombre CD4 positivo. Aplique una puerta de polígono a la población CD4 negativa y asígnele el nombre CD8. Seleccione la población sin TB y cambie los ejes a CD56 versus mieloide.
Aplique una puerta de polígono a la población CD56 positiva total y asígnele el nombre de células NK. Luego aplique una puerta de polígono a la población CD56 negativa y mieloide positiva, y asígnele mieloide. Cree una tabla para las estadísticas de porcentaje y recuento de todas las poblaciones y expórtela a una hoja de cálculo.
Calcule el porcentaje de quimerismo hCD45 utilizando la fórmula indicada. Después de cultivar células tumorales en el ratón y administrar tratamientos farmacológicos, cosechar los tejidos. Coloque el mouse en una tabla de disección de espuma con alfileres para mantenerlos en su lugar y los brazos y las piernas extendidos a 45 grados.
Haga una incisión en la mitad del torso comenzando cerca de la pelvis y extendiéndose hasta la barbilla. Tire de la piel hacia el borde y manténgala en su lugar con alfileres. Extraiga los ganglios linfáticos utilizando fórceps finos en el orden axilar, cervical, mesentérico, inguinal e hiatal.
Coloque los ganglios linfáticos en un lado del portaobjetos de vidrio esmerilado en una placa de Petri en ocho mililitros de medio de cosecha. Sosteniendo los portaobjetos en ángulos perpendiculares con los bordes esmerilados hacia adentro, presione suavemente los tejidos hasta que se libere el contenido celular. Enjuague el portaobjetos varias veces separándolos y juntos para liberar el número máximo de células.
Recoja las células con una pipeta de vidrio de cinco pulgadas y fíjelas a través de una pipeta de algodón de nueve pulgadas en un tubo cónico de 15 mililitros etiquetado. Luego, extraiga el tumor del flanco abierto sosteniendo el tumor con fórceps mientras corta lentamente los márgenes del tumor con tijeras de disección. Pesar el tumor y extirpar 1/4 del tumor para el procesamiento de ARN e inmunohistoquímica.
Coloque los 3/4 restantes del tumor en un plato de seis centímetros y córtelo en pedazos de un milímetro con una hoja de bisturí. Transfiera las piezas tumorales a un tubo de disociación. Luego enjuague el plato con un medio TIL incompleto y agréguelo al tubo.
Agregue la preparación de colagenasa y disocie el tejido usando disociación mecánica a 37 grados centígrados durante 30 minutos a una hora. Pase la suspensión sobre un filtro de 100 micras en un tubo cónico de 50 mililitros y enjuague el filtro con 10 mililitros de medios completos TIL. Centrifugar y resuspender el pellet en el medio de cosecha suficiente con DNasa, de modo que la suspensión de las células pueda pasar fácilmente a través de una punta de pipeta P1000 y registrar el volumen para el análisis posterior.
En PDX CRC 307P, el tratamiento combinado ralentizó el crecimiento del tumor, según lo determinado por los volúmenes de crecimiento tumoral a lo largo del tiempo, el peso del tumor y la tasa de crecimiento específica. PDX CRC 307M probado en una cohorte diferente de ratones se vio menos afectado por el mismo tratamiento combinado en ratones HIS BRGS. Con base en el quimerismo general humano positivo para hCD45 y hCD3 positivo para células T humanas en la sangre antes de la implantación del tumor, ambos parámetros aumentaron en el sistema inmune periférico y el TIL en combinación con ratones tratados con CRC 307P, pero no en el modelo CRC 307M.
La investigación de las células T humanas reveló más células T activadas en los tumores CRC 307P, pero no la linfa de ratones tratados con combinación. Además, hubo más células T CD8 positivas para memoria efectora y menos células T positivas para TIM-3 en los tumores CCR 307P tratados con combinación. En contraste, esta diferencia no se notó en el modelo CRC 307M.
Además, no se observaron cambios en las frecuencias de las poblaciones de células T citotóxicas entre los ratones tratados con combinación, aunque se observaron células T citotóxicas más altas en los no tratados. El tratamiento combinado no afectó las frecuencias de Tregs en los órganos linfáticos del CCR 307P ni en los tumores, aunque los datos del CCR 307M mostraron una tendencia a la reducción de las Tregs. Los cambios relacionados con el sistema inmunitario en las células tumorales se elevaron mediante citometría de flujo.
Se observó un aumento de la expresión de MHC clase I y clase II en las células tumorales CRC 307P extirpadas de ratones HIS BRGS tratados con combinación. En el modelo CRC 307M, el mismo tratamiento farmacológico indujo la expresión de HLA clase II en las células tumorales. Del mismo modo, el tratamiento combinado resultó en un aumento de la expresión de PD-L1 en las células tumorales CRC 307P positivas para EpCAM.
Finalmente, se investigaron las correlaciones de las respuestas inmunes con el crecimiento tumoral. El aumento de las células T CD4 positivas mostró una correlación significativa con un crecimiento tumoral más pequeño, y más específicamente las células T activadas positivas para HLA-DR en la combinación de ratones HIS tratados. Técnica estéril mientras se aíslan las células CD34 positivas, ya que los ratones son extremadamente inmunodeficientes.
El quimerismo resultante es variable dentro y entre los donantes de sangre del cordón umbilical, y las células T tienen la mayor variación. Se pueden realizar combinaciones ilimitadas de inmunoterapia, así como estudios cinéticos mecanicistas y de dosificación de fármacos, por ejemplo, la eliminación de células T CD8 para confirmar su función. Es importante destacar que también se pueden estudiar las toxicidades relacionadas con las drogas.
Proporcionó un modelo preclínico más relevante y accesible para probar inmunoterapias humanas para su traducción a la clínica. Varios ensayos clínicos están en curso ahora basados en estos datos.
