الطرد المركزي على الطاولة هو عملية مفتوحة ويدوية يصعب توسيع نطاقها. يوضح بروتوكولنا كيفية إغلاق وأتمتة تفكك وغسل وحصاد الخلايا الجذعية الوسيطة ، أو MSCs ، في جولة واحدة. الإعداد بسيط.
يمكن تنفيذ العملية بأكملها خارج خزانة السلامة الأحيائية في مرفق cGMP من الفئة. تقلل المعالجة الآلية المغلقة للخلايا من خطوات المناولة اليدوية التي قد تكون عرضة للمخاطر وتمكن من الامتثال لممارسات التصنيع الجيدة cGMP. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع الخلايا الأخرى الموسعة في أنظمة الاستزراع متعددة الطبقات.
يسمح نظام الطرد المركزي بالتدفق المعاكس بتعديل أي خطوات بروتوكول لتطبيقات مختلفة. وسيظهر هذا الإجراء الدكتور آلان لام ، عالم الموظفين من مجموعة المعالجة الحيوية للخلايا الجذعية في معهد تكنولوجيا المعالجة الحيوية ، نجم في سنغافورة. لبدء تجميع مجموعة أدوات الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس للاستخدام مرة واحدة ، قم بتوصيل المجموعة ذات الاستخدام الواحد بأكياس نقل PVC ذات الاستخدام الواحد عبر لحام الأنبوب ، كما هو موضح في الصورة.
بعد ذلك ، داخل خزانة السلامة البيولوجية ، قم بتوصيل دورق متعدد الطبقات من 10 طبقات يحتوي على خلايا جذعية متوسطة بشرية مشتقة من هلام وارتون أو وجيلي HMSCs من وارتون بمجموعة الأنابيب المخصصة. انقل وعاء الاستزراع المكون من 10 طبقات المرفق مع مجموعة الأنابيب المخصصة إلى مقعد ولحامها بالخط E من المجموعة ذات الاستخدام الواحد. أيضًا. قم بلحام منفذ عينة معقمة لخط G من المجموعة ذات الاستخدام الفردي عالية التدفق.
بعد ذلك ، قم بتوصيل خط الحصاد H بإغراء معقم ، مزود بحقنة سعة 50 ملليلتر. لإعداد تشغيل الجهاز ، قم بتشغيل الجهاز باستخدام مفتاح التبديل الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز وقم بتوصيل الكمبيوتر المحمول بمنفذ USBC على الجهاز باستخدام كابل USBC المرفق. قم بتشغيل واجهة المستخدم الرسومية للطرد المركزي Counterflow ، أو برنامج واجهة المستخدم الرسومية من سطح المكتب أو قائمة ابدأ وقم بتسجيل الدخول.
بعد ذلك ، قم بتحميل البروتوكول بالنقر فوق حدد بروتوكول زر في صفحة الترحيب الرئيسية. بعد ذلك ، اضغط على زر إلغاء القفل الأزرق على الجهاز وافتح الباب الزجاجي لتحميل المجموعة المجمعة ذات الاستخدام الواحد على نظام الطرد المركزي المعاكس. ابدأ بتعليق الأكياس على خطافات الشماعات بترتيب يصطفها بشكل أفضل مع منافذ الأنبوب الموجودة على شرائط مستشعر الفقاعات مع وضع الدورق متعدد الطبقات المكون من 10 طبقات بزاوية.
قم بمحاذاة المجموعة باستخدام زري موقع المجموعة. قم بتمديد أنبوب المضخة حول المضخة التمعجية واضغط على الموصل الأبيض على شكل لمبة في مكانه. قم بتوصيل غرفة الطرد المركزي عن طريق رفع الرافعة الفضية لحامل غرفة الطرد المركزي ذات التدفق المعاكس وتأمينها عن طريق إعادة الرافعة إلى وضعها الرأسي.
اضغط على الأنبوب من كل منفذ على المجموعة إلى المسارات على طول شرائط مستشعر الفقاعة. أغلق الباب بالضغط لأسفل على مزلاج الباب. ضرب زر البدء في واجهة المستخدم الرسومية.
ستظهر قائمة تحقق. العناصر الأربعة الأولى هي فحوصات الأدوات ، في حين أن الأخيرين هما فحوصات المستخدم. في هذه المرحلة ، تأكد من تطابق الأكياس والوصلات مع صورة المجموعة وأن المشابك اليدوية مفتوحة.
اضغط على تأكيد لإظهار شاشة مدخلات البروتوكول. قم بتعيين قيمة مربع حوار إدخال البيانات أو حجم الحصاد على أنها 45 ملليلتر واضغط على تأكيد. اضغط على زر البدء الأخضر على الجهاز لبدء تشغيل البروتوكول.
بمجرد اكتمال التحضير الأولي ، تأكد من ضخ الوسط المستهلك بالكامل في كيس النفايات. في خطوات الإيقاف المؤقت كما هو موضح في جدول سير العمل ، ارفع القارورة متعددة الطبقات لأعلى ورجها لتوزيع المخزن المؤقت بالتساوي على جميع الأدراج. بمجرد الانتهاء ، ضع القارورة متعددة الطبقات المكونة من 10 طبقات مرة أخرى في موضع السحب الأصلي للخطوات التالية.
في الخطوتين 20 و 23 ، تأكد من نقل الخلايا التربسينية بالكامل إلى الكيس الوسيط. امزج الكيس الوسيط جيدا يدويا في الخطوة 25. في الخطوة 26 ، استخدم حقنة إغراء سعة 2 ملليلتر لأخذ عينات من خلال منفذ أخذ العينات.
في الخطوتين 29 و 30 ، تحقق من التكوين المستقر لطبقة الخلية المميعة. يجب أن يكون مثل طبقة الخلية المميعة الموضحة هنا. اكتمل التشغيل عند المنحدر لإيقاف الخطوة ، وسيتم إغلاق جميع قيم الضغط على نظام الطرد المركزي للتدفق المعاكس تلقائيا.
بعد اكتمال تشغيل البروتوكول ، اضغط على زر إلغاء القفل الأزرق على الجهاز وافتح الباب الزجاجي. قم بإغلاق خط الحصاد بشكل معقم باستخدام سدادة أنبوبية محمولة يدويا وانقل بعناية المحقنة المختومة المملوءة بحصاد الخلايا المركزة إلى خزانة الأمان البيولوجي لعد الخلايا والحفظ بالتبريد. افصل الغرفة مرة أخرى باستخدام الرافعة.
اسحب موصل المصباح من تركيبته وارفع المجموعة بعناية بعيدا وتخلص منها في كيس بيولوجي. نظف الأداة باستخدام مناديل الإيثانول وأغلق الباب. أخيرا ، أغلق تطبيق واجهة المستخدم الرسومية أولا قبل إيقاف تشغيل المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.
انتشرت MSCs Jelly من وارتون بشكل جيد عند توسيعها في كل من الوسائط المحتوية على المصل والخالية من المصل والخالية من الأجانب. ومع ذلك ، فإن أولئك الذين في وسط خال من المصل وخالي من xeno أظهروا مورفولوجيا أطول قليلا على شكل مغزل يشبه الخلايا الليفية ، مع متوسط حجم خلية أكبر يبلغ 17 ميكرون ، مقارنة ب 15 ميكرون في وسط المصل. في كلا الوسائطين عبر الممرات الثلاثة ، وصلت Jelly HMSCs في وارتون باستمرار إلى كثافة خلايا قصوى تبلغ حوالي 23000 خلية لكل سنتيمتر مربع ووقت مضاعفة السكان يبلغ 34 ساعة.
عندما تم توسيع Jelly HMSCs في وارتون في أوعية استزراع من 10 طبقات باستخدام الطرد المركزي للتدفق المعاكس ، تم تحقيق انخفاض في الحجم بمقدار عشرة أضعاف ، مما أدى إلى توليد تركيزات خلايا تصل إلى 5.3 مليون خلية لكل ملليلتر. حقق البروتوكول باستمرار استردادا عاليا للخلايا يبلغ حوالي 98٪ وقابلية عالية للخلية تبلغ حوالي 99٪ لثلاث عمليات تشغيل مستقلة. عرضت جيلي HMSCs من وارتون التي تم حصادها باستخدام كلتا الطريقتين ملامح مميزة لعلامات السطح تكون CD73 و CD90 و CD105 إيجابية ، بالإضافة إلى CD34 و CD45 سلبية.
أظهرت الخلايا التي تم حصادها من الطرد المركزي عكس التدفق مقايسة مماثلة لوحدة تشكيل المستعمرات أو إمكانات CFU ، مقارنة بتلك التي يتم حصادها بواسطة الطرد المركزي اليدوي. في كلتا الطريقتين ، احتفظت الخلايا بالقدرة على التمايز إلى خلايا دهنية وبانيات عظمية وخلايا غضروفية. كانت ملامح إفراز السيتوكين للخلايا بعد الطرد المركزي بعد التدفق المعاكس قابلة للمقارنة مع الطرد المركزي قبل التدفق المعاكس.
تأكد من تجميع مجموعة الاستخدام الفردي بالإشارة إلى إعداد السرير ، واستبدالها في منشئ بروتوكول نظام الانصهار المركزي للتدفق المعاكس. يمكن استخدام بروتوكول غسل الشوائب المتبقية من المنتج النهائي في التطبيقات السريرية لدعم المستخدمين في تلبية معايير إطلاق الدفعة الخاصة بهم. لتسريع عملية نقل السوائل للمعالجة على نطاق واسع ، يمكن استخدام المضخات الخارجية لنقل محتويات التربسين إلى كيس نقل أولا ، بدلا من الحصاد مباشرة من القارورة متعددة الطبقات.
