צנטריפוגת Benchtop היא תהליך פתוח וידני שמאתגר לקנה מידה. הפרוטוקול שלנו מראה כיצד לסגור ולהפוך את הדיסוציאציה, השטיפה והקציר של תאי גזע מזנכימליים, או MSC, לאוטומטיים בריצה אחת. ההתקנה פשוטה.
התהליך כולו יכול להתבצע מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית במתקן cGMP (תנאי ייצור נאותים) בכיתה. עיבוד אוטומטי סגור של תאים מפחית את שלבי הטיפול הידניים שעלולים להיות מועדים לסיכונים ומאפשר עמידה בתקני cGMP. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגי תאים אחרים המורחבים במערכות תרבית רב שכבתיות.
מערכת הצנטריפוגה Counterflow מאפשרת שינוי של כל שלבי הפרוטוקול עבור יישומים שונים. מי שידגים הליך זה יהיה ד"ר אלן לאם, מדען צוות מקבוצת העיבוד הביולוגי של תאי גזע במכון לטכנולוגיית ביו-עיבוד, כוכב בסינגפור. כדי להתחיל בהרכבת ערכת הצנטריפוגה החד-פעמית נגד הזרם, חבר את הערכה החד-פעמית לשקיות העברת PVC חד-פעמיות באמצעות ריתוך צינורות, כמתואר בתמונה.
לאחר מכן, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, חברו בקבוק רב-שכבתי בן 10 שכבות המכיל תאי גזע מזנכימליים אנושיים שמקורם בג'לי של וורטון או ג'לי HMSCs של וורטון למכלול צינורות מותאם אישית. מעבירים את כלי התרבית המחובר בן 10 השכבות עם מכלול הצינור המותאם אישית לספסל ומרתך אותו לקו E של הערכה החד-פעמית. גם. רתכו יציאת דגימה סטרילית לקו G של הערכה החד-פעמית בעלת הזרימה הגבוהה.
לאחר מכן, חבר את קו הקציר H לפיתיונות סטריליים, מצויד מזרק 50 מיליליטר. כדי להגדיר את הפעלת לוח המחוונים, הפעל את ההתקן באמצעות המתג הדו-מצבי בחלק האחורי של המכשיר וחבר את המחשב הנייד ליציאת ה- USBC במכשיר באמצעות כבל ה- USBC שסופק. הפעל את Counterflow Centrifuge Graphical User Interface, או תוכנת GUI מתפריט שולחן העבודה או ההתחלה והיכנס.
לאחר מכן, טען את הפרוטוקול על ידי לחיצה על בחר פרוטוקול כפתור בדף הפתיחה הראשי. לאחר מכן, לחץ על כפתור ביטול הנעילה הכחול במכשיר ופתח את דלת הזכוכית כדי לטעון את הערכה החד-פעמית שהורכבה על מערכת הצנטריפוגה Counterflow. התחל בתליית השקיות על ווי הקולב בסדר המיישר אותן בצורה הטובה ביותר עם יציאות הצינור ברצועות חיישן הבועות עם הבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות הממוקם בזווית.
יישרו את הערכה עם שני לחצני המיקום של הערכה. מתחו את צינור המשאבה סביב המשאבה הפריסטלטית ולחצו על המחבר בצורת נורה לבנה למקומו. חבר את תא הצנטריפוגה על ידי הרמת ידית הכסף של מוביל תא הצנטריפוגות נגד הזרימה ואבטחתו על ידי החזרת הידית למקומה הזקוף.
לחץ על הצינור מכל יציאה בערכה לתוך המסילות לאורך רצועות חיישן הבועות. סגור את הדלת על ידי לחיצה כלפי מטה על תפס הדלת. הכה את ליזום כפתור בממשק המשתמש הגרפי.
תופיע רשימת פעולות לביצוע. ארבעת הפריטים הראשונים הם בדיקות מכשירים, ואילו שני האחרונים הם בדיקות משתמשים. בשלב זה, ודא שהשקיות והחיבורים תואמים לתמונת הערכה והמהדקים הידניים פתוחים.
הקש על אישור כדי להציג את מסך הקלט של הפרוטוקול. הגדר את ערך תיבת הדו-שיח של הזנת הנתונים או נפח הקציר כ- 45 מיליליטר ולחץ על אישור. לחץ על לחצן ההפעלה הירוק במכשיר כדי להתחיל את הפעלת הפרוטוקול.
לאחר השלמת הפריימינג הראשוני, ודא שהמדיום המשומש נשאב במלואו לתוך שקית האשפה. בשלבי השהיה כפי שמסומנים בטבלת זרימת העבודה, הרם את הבקבוק הרב-שכבתי כלפי מעלה ונער אותו כדי לפזר את המאגר באופן שווה לכל המגשים. לאחר שתסיים, החזירו את הבקבוק הרב-שכבתי בן 10 השכבות למיקום הציור המקורי שלו לשלבים הבאים.
בשלבים 20 ו-23, ודא שתאי הטריפסינציה מועברים במלואם לשקית הביניים. ערבבו היטב את תיק הביניים, ידנית, בשלב 25. בשלב 26, השתמש במזרק פיתוי של שני מיליליטר כדי לדגום דרך יציאת הדגימה.
בשלבים 29 ו -30, בדוק את היווצרות יציבה של מיטת התא הנוזלית. זה צריך להיות כמו מיטת התא הנוזלית המוצגת כאן. הריצה הושלמה ברמפה כדי לעצור את המדרגה, וכל ערכי הצביטה במערכת הצנטריפוגה של זרימה נגדית ייסגרו אוטומטית.
לאחר השלמת הפעלת הפרוטוקול, לחץ על כפתור ביטול הנעילה הכחול במכשיר ופתח את דלת הזכוכית. אטמו את קו הקציר באמצעות אוטם צינור ידני והעבירו בזהירות את המזרק האטום המלא בקציר התאים המרוכז לארון הבטיחות הביולוגי לצורך ספירת תאים ושימור בהקפאה. נתקו שוב את החדר באמצעות הידית.
משוך את מחבר הנורה מההתאמה שלו ובזהירות הרם את הערכה והשלך אותה לשקית מסוכנת ביולוגית. נקו את המכשיר באמצעות מגבוני אתנול וסגרו את הדלת. לבסוף, סגור תחילה את יישום ממשק המשתמש הגרפי לפני כיבוי המתג בחלק האחורי של המכשיר.
Jelly MSCs של Wharton's התרבו היטב כאשר הורחבו הן במדיה המכילה סרום והן במדיה נטולת קסנו. עם זאת, אלה בתווך נטול סרום וללא קסנו הציגו מורפולוגיה מעט ארוכה יותר דמוית ציר דמוי פיברובלסט, עם גודל תא ממוצע גדול יותר של 17 מיקרון, בהשוואה ל -15 מיקרון בתווך הסרום. בשני המדיות לאורך שלושת המעברים, הג'לי HMSCs של וורטון הגיעו באופן עקבי לצפיפות תאים מקסימלית של כ -23, 000 תאים לסנטימטר מרובע וזמן הכפלת אוכלוסייה של 34 שעות.
כאשר הורחבו הג'לי HMSCs של וורטון בכלי תרבית בעלי 10 שכבות באמצעות צנטריפוגת הזרימה הנגדית שהודגמה, הושגה הפחתת נפח של פי עשרה, ויצרה ריכוזי תאים גבוהים עד 5.3 מיליון תאים למיליליטר. הפרוטוקול השיג באופן עקבי התאוששות תאים גבוהה של כ-98% ויכולת קיום תאים גבוהה של כ-99% עבור שלוש ריצות עצמאיות. הג'לי HMSCs של וורטון שנקטפו בשתי השיטות הציגו פרופילי סמן פני שטח אופייניים שהם CD73, CD90 ו- CD105 חיוביים, כמו גם CD34 ו- CD45 שליליים.
התאים שנקצרו מצנטריפוגות נגד זרימה הציגו פוטנציאל דומה של יחידת פיברובלסטים יוצרי מושבה או פוטנציאל CFU, בהשוואה לתאים שנקצרו באמצעות צנטריפוגה ידנית. בשתי השיטות, התאים שמרו על היכולת להתמיין לאדיפוציטים, אוסטאובלסטים וכונדרוציטים. פרופילי הפרשת הציטוקינים של תאים לאחר צנטריפוגה של זרימה נגדית היו דומים לצנטריפוגות לפני זרימה נגדית.
הקפד להרכיב את הערכה לשימוש חד פעמי תוך התייחסות לסידור המיטה, החלף אותה בבונה פרוטוקולי מערכת צנטריפוזיה זרם נגדי זה. ניתן להשתמש בפרוטוקול לשטיפת שאריות זיהומים מהמוצר הסופי ביישומים קליניים כדי לתמוך במשתמשים בעמידה בקריטריוני שחרור המנה שלהם. כדי לזרז את תהליך העברת הנוזלים לעיבוד בקנה מידה גדול, ניתן להשתמש במשאבות חיצוניות כדי להעביר תחילה את תכולת הטריפסיניז לשקית העברה, במקום לקצור ישירות מהבקבוק הרב-שכבתי.
