Die Tischzentrifugation ist ein offener und manueller Prozess, der nur schwer zu skalieren ist. Unser Protokoll zeigt, wie die Dissoziation, das Waschen und die Ernte von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem einzigen Durchlauf geschlossen und automatisiert werden können. Die Einrichtung ist einfach.
Der gesamte Prozess kann außerhalb der Biosicherheitswerkbank in einer Anlage der Klasse cGMP durchgeführt werden. Die geschlossene automatisierte Zellverarbeitung reduziert manuelle Handhabungsschritte, die risikoanfällig sein könnten, und ermöglicht die Einhaltung der cGMP-Standards. Diese Methode kann auch auf andere Zelltypen angewendet werden, die in mehrschichtigen Kultursystemen expandiert wurden.
Das Gegenstrom-Zentrifugationssystem ermöglicht die Modifikation beliebiger Protokollschritte für verschiedene Anwendungen. Dieses Verfahren wird von Dr. Alan Lam, wissenschaftlicher Mitarbeiter der Stammzell-Bioprozess-Gruppe am Bioprocessing Technology Institute, A Star in Singapur, demonstriert. Um mit der Montage des Einweg-Gegenstrom-Zentrifugationskits zu beginnen, verbinden Sie das Einweg-Kit mit den Einweg-PVC-Transferbeuteln durch Rohrschweißen, wie in der Abbildung gezeigt.
Befestigen Sie dann in einer Biosicherheitswerkbank einen 10-lagigen mehrschichtigen Kolben mit konfluierenden, aus Wharton's Jelly gewonnenen humanen mesenchymalen Stammzellen oder Wharton's Jelly HMSCs an der kundenspezifischen Schlauchbaugruppe. Übertragen Sie das beigefügte 10-lagige Kulturgefäß mit der kundenspezifischen Schlauchbaugruppe auf eine Bank und schweißen Sie es an die Linie E des Einweg-Kits. Auch. Schweißen Sie einen sterilen Probenanschluss an die Leitung G des High-Flow-Einwegkits.
Schließen Sie als Nächstes die Ernteschnur H an einen sterilen Köder an, der mit einer 50-Milliliter-Spritze ausgestattet ist. Um den Gerätelauf einzurichten, schalten Sie das Gerät mit dem Kippschalter auf der Rückseite des Geräts ein und schließen Sie den Laptop mit dem mitgelieferten USBC-Kabel an den USBC-Anschluss des Geräts an. Führen Sie die grafische Benutzeroberfläche der Gegenstromzentrifuge oder die GUI-Software über den Desktop oder das Startmenü aus und melden Sie sich an.
Laden Sie dann das Protokoll, indem Sie auf der Hauptbegrüßungsseite auf die Schaltfläche Protokoll auswählen klicken. Drücken Sie anschließend die blaue Entriegelungstaste am Gerät und öffnen Sie die Glasklappe, um das zusammengebaute Einweg-Kit in das Gegenstrom-Zentrifugationssystem zu laden. Beginnen Sie damit, die Beutel an den Kleiderbügelhaken in einer Reihenfolge aufzuhängen, die sie am besten mit den Rohranschlüssen an den Blasensensorstreifen ausrichtet, wobei der 10-lagige mehrschichtige Kolben schräg platziert ist.
Richten Sie das Kit mit den beiden Kit-Positionierungstasten aus. Spannen Sie den Pumpenschlauch um die Peristaltikpumpe und drücken Sie den weißen kugelförmigen Stecker fest. Befestigen Sie die Zentrifugenkammer, indem Sie den silbernen Hebel des Gegenstrom-Zentrifugenkammerträgers anheben und sichern, indem Sie den Hebel wieder in seine aufrechte Position bringen.
Drücken Sie den Schlauch von jedem Anschluss des Kits in die Schienen entlang der Blasensensorstreifen. Schließen Sie die Tür, indem Sie die Türverriegelung nach unten drücken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initiieren in der GUI.
Eine Checkliste wird angezeigt. Bei den ersten vier Punkten handelt es sich um Instrumentenprüfungen, während es sich bei den letzten beiden um Benutzerprüfungen handelt. Stellen Sie zu diesem Zeitpunkt sicher, dass die Taschen und Anschlüsse mit dem Kit-Bild übereinstimmen und die manuellen Klemmen geöffnet sind.
Drücken Sie auf Bestätigen, um den Bildschirm Protokolleingänge anzuzeigen. Legen Sie den Wert für die Dateneingabe oder das Erntevolumen auf 45 Milliliter fest, und klicken Sie auf Bestätigen. Drücken Sie die grüne Starttaste am Gerät, um den Protokolllauf zu starten.
Stellen Sie nach Abschluss der ersten Ansaugung sicher, dass das verbrauchte Medium vollständig in den Abfallsack abgepumpt wird. Heben Sie in den in der Workflow-Tabelle markierten Pausenschritten den mehrschichtigen Kolben an und schütteln Sie ihn, um den Puffer gleichmäßig auf alle Schalen zu verteilen. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie den 10-lagigen mehrschichtigen Kolben für die nächsten Schritte wieder in seine ursprüngliche Ziehposition.
Stellen Sie in den Schritten 20 und 23 sicher, dass die trypsinisierten Zellen vollständig in den Zwischenbeutel überführt werden. Mischen Sie den Zwischenbeutel in Schritt 25 manuell gut. Verwenden Sie in Schritt 26 eine Zwei-Milliliter-Köderspritze, um die Probe durch die Probenahmeöffnung zu nehmen.
Überprüfen Sie in den Schritten 29 und 30 die stabile Ausbildung des Wirbelzellenbettes. Es sollte wie das hier gezeigte Wirbelzellenbett sein. Der Lauf ist an der Rampe abgeschlossen, um den Schritt zu stoppen, und alle Quetschwerte des Gegenstromzentrifugationssystems schließen sich automatisch.
Drücken Sie nach Abschluss des Protokolllaufs die blaue Entriegelungstaste am Gerät und öffnen Sie die Glasklappe. Verschließen Sie die Erntelinie aseptisch mit einem Handversiegeler und überführen Sie die versiegelte Spritze, die mit der konzentrierten Zellernte gefüllt ist, vorsichtig in die biologische Sicherheitswerkbank zur Zellzählung und Kryokonservierung. Nehmen Sie die Kammer mit dem Hebel wieder ab.
Ziehen Sie den Lampenstecker aus seiner Fassung, heben Sie das Kit vorsichtig ab und entsorgen Sie es in einem Biohazard-Beutel. Reinigen Sie das Gerät mit Ethanoltüchern und schließen Sie die Tür. Schließen Sie schließlich zuerst die GUI-Anwendung, bevor Sie den Schalter auf der Rückseite des Instruments ausschalten.
Die Wharton's Jelly MSCs vermehrten sich gut, wenn sie sowohl in serumhaltigen als auch in serumfreien, xenofreien Medien expandiert wurden. Diejenigen in serumfreiem, xenofreiem Medium zeigten jedoch eine etwas längere fibroblastenartige spindelförmige Morphologie mit einer größeren durchschnittlichen Zellgröße von 17 Mikrometern im Vergleich zu 15 Mikrometern im Serummedium. In beiden Medien erreichten die Wharton's Jelly HMSCs über die drei Passagen hinweg durchweg eine maximale Zelldichte von etwa 23.000 Zellen pro Quadratzentimeter und eine Populationsverdopplungszeit von 34 Stunden.
Als die Wharton's Jelly HMSCs in 10-Schicht-Kulturgefäßen unter Verwendung der demonstrierten Gegenstromzentrifugation expandiert wurden, wurde eine zehnfache Volumenreduktion erreicht, wodurch Zellkonzentrationen von bis zu 5,3 Millionen Zellen pro Milliliter erzeugt wurden. Das Protokoll erzielte durchweg eine hohe Zellrückgewinnung von etwa 98 % und eine hohe Zellviabilität von etwa 99 % für drei unabhängige Durchläufe. Die Wharton's Jelly HMSCs, die mit beiden Methoden geerntet wurden, wiesen charakteristische Oberflächenmarkerprofile auf, die CD73-, CD90- und CD105-positiv sowie CD34- und CD45-negativ sind.
Die Zellen, die aus der Gegenstromzentrifugation gewonnen wurden, zeigten einen ähnlichen koloniebildenden Fibroblasten-Assay oder ein ähnliches KBE-Potenzial im Vergleich zu denen, die durch manuelle Zentrifugation gewonnen wurden. Bei beiden Methoden behielten die Zellen die Fähigkeit, sich in Adipozyten, Osteoblasten und Chondrozyten zu differenzieren. Die Zytokinsekretionsprofile der Zellen nach der Gegenstromzentrifugation waren vergleichbar mit denen der Prä-Gegenstromzentrifugation.
Stellen Sie sicher, dass Sie das Einweg-Kit in Bezug auf den Bettaufbau zusammenstellen und in diesem Counterflow Centrifusion System Protocol Builder verschieben. Das Protokoll zum Waschen von Restverunreinigungen aus dem Endprodukt kann in klinischen Anwendungen verwendet werden, um die Anwender bei der Erfüllung ihrer Chargenfreigabekriterien zu unterstützen. Um den Prozess des Flüssigkeitstransfers für die Verarbeitung im großen Maßstab zu beschleunigen, können externe Pumpen verwendet werden, um den trypsinisierten Inhalt zuerst in einen Transferbeutel zu füllen, anstatt direkt aus dem mehrschichtigen Kolben zu ernten.
