Настольное центрифугирование — это открытый и ручной процесс, который сложно масштабировать. Наш протокол показывает, как закрыть и автоматизировать диссоциацию, промывку и сбор мезенхимальных стволовых клеток или МСК за один прогон. Настройка проста.
Весь процесс может быть выполнен вне шкафа биобезопасности на объекте класса cGMP. Закрытая автоматизированная обработка ячеек сокращает количество ручных операций, которые могут быть подвержены риску, и обеспечивает соответствие требованиям cGMP. Этот метод может быть применен к другим типам клеток, разросшихся в многослойных культуральных системах.
Система противоточного центрифугирования позволяет модифицировать любые этапы протокола для различных применений. Эту процедуру продемонстрирует доктор Алан Лам, научный сотрудник группы биообработки стволовых клеток в Институте технологий биообработки, звезда в Сингапуре. Чтобы начать сборку одноразового комплекта противоточного центрифугирования, соедините одноразовый комплект с одноразовыми пакетами для переноса из ПВХ с помощью сварки труб, как показано на рисунке.
Затем, внутри шкафа биобезопасности, прикрепите 10-слойную многослойную колбу, содержащую сливающиеся мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из желе Уортона, или HMSC Wharton's Jelly, к узлу нестандартной трубки. Перенесите прикрепленный 10-слойный сосуд для культуры с изготовленной на заказ трубкой в сборе на стенд и приварите его к линии E одноразового комплекта. Тоже. приварить отверстие для стерильного образца к линии G одноразового комплекта с высоким расходом.
Затем подключите линию сбора урожая H к стерильной приманке, оснащенной шприцем объемом 50 миллилитров. Чтобы настроить работу прибора, включите прибор с помощью тумблера на задней панели прибора и подключите ноутбук к порту USBC на приборе с помощью прилагаемого кабеля USBC. Запустите графический интерфейс пользователя противоточной центрифуги или программное обеспечение с графическим интерфейсом с рабочего стола или из меню «Пуск» и войдите в систему.
Затем загрузите протокол, нажав кнопку «Выбрать протокол» на главной странице приветствия. Затем нажмите синюю кнопку разблокировки на приборе и откройте стеклянную дверцу, чтобы загрузить собранный одноразовый комплект в систему противоточного центрифугирования. Начните с того, что повесьте пакеты на крючки вешалки в порядке, который лучше всего совпадает с отверстиями для трубок на полосках пузырьковых датчиков с 10-слойной многослойной колбой, расположенной под углом.
Выровняйте комплект с помощью двух кнопок расположения комплекта. Растяните трубку насоса вокруг перистальтического насоса и прижмите белый колбовидный соединитель на место. Прикрепите камеру центрифуги, подняв серебристый рычаг держателя камеры противоточной центрифуги и закрепив его, вернув рычаг в вертикальное положение.
Вдавите трубку из каждого порта комплекта в дорожки вдоль пузырьковых сенсорных планок. Закройте дверь, нажав на дверную защелку. Нажмите кнопку «Инициировать» в графическом интерфейсе.
Появится контрольный список. Первые четыре пункта — это проверки приборов, а последние два — проверки пользователя. На этом этапе убедитесь, что мешки и соединения соответствуют изображению комплекта, а ручные зажимы открыты.
Нажмите «Подтвердить», чтобы отобразить экран ввода протокола. Установите значение диалогового окна ввода данных или объема сбора урожая равным 45 миллилитрам и нажмите «Подтвердить». Нажмите зеленую кнопку запуска на приборе, чтобы начать запуск протокола.
После завершения первоначальной заливки убедитесь, что отработанная среда полностью откачана в мешок для отходов. На шагах паузы, как указано в таблице рабочих процессов, поднимите многослойную колбу вверх и встряхните ее, чтобы распределить буфер равномерно по всем лоткам. После завершения поместите 10-слойную многослойную колбу обратно в исходное положение для рисования для следующих шагов.
На этапах 20 и 23 убедитесь, что трипсинизированные клетки полностью перенесены в промежуточный мешок. Хорошо перемешайте промежуточный пакет вручную, на шаге 25. На шаге 26 используйте двухмиллилитровый шприц-приманку для отбора проб через отверстие для отбора проб.
На этапах 29 и 30 проверьте стабильное образование слоя псевдоожиженной ячейки. Это должно быть похоже на псевдоожиженный клеточный слой, показанный здесь. Прогон завершен на ступени от рампы до остановки, и все значения защемления в системе противоточного центрифугирования автоматически закроются.
После завершения выполнения протокола нажмите синюю кнопку разблокировки на приборе и откройте стеклянную дверцу. Асептически запечатайте линию сбора урожая с помощью ручного запайщика пробирок и осторожно перенесите запечатанный шприц, наполненный концентрированным клеточным сбором, в шкаф биологической безопасности для подсчета клеток и криоконсервации. Снова отсоедините патронник с помощью рычага.
Вытащите разъем лампы из штуцера, осторожно извлеките комплект и утилизируйте его в пакет с биологической опасностью. Очистите прибор салфетками с этанолом и закройте дверцу. Наконец, сначала закройте приложение с графическим интерфейсом, прежде чем выключать переключатель на задней панели прибора.
МСК Wharton's Jelly хорошо размножались при расширении как в сывороткосодержащих, так и в безсывороточных, не содержащих ксено. Однако те, кто находился в среде, свободной от сыворотки и ксено, демонстрировали немного более длинную фибробластоподобную веретенообразную морфологию с большим средним размером клеток 17 микрон по сравнению с 15 микронами в сыворотке крови. В обеих средах в трех проходах HMSC Wharton's Jelly последовательно достигали максимальной плотности клеток около 23 000 клеток на квадратный сантиметр и времени удвоения популяции в 34 часа.
Когда HMSC Wharton's Jelly были расширены в 10-слойных культивальных сосудах с использованием продемонстрированного противоточного центрифугирования, было достигнуто десятикратное уменьшение объема, в результате чего концентрация клеток достигала 5,3 миллиона клеток на миллилитр. Протокол последовательно достигал высокого извлечения клеток около 98% и высокой жизнеспособности клеток около 99% в течение трех независимых запусков. HMSC Wharton's Jelly, собранные с использованием обоих методов, показали характерные профили поверхностных маркеров, которые являются положительными CD73, CD90 и CD105, а также отрицательными CD34 и CD45.
Клетки, собранные с помощью противоточного центрифугирования, показали аналогичный анализ фибробластов колониеобразующих единиц или потенциал КОЕ по сравнению с клетками, собранными с помощью ручного центрифугирования. В обоих методах клетки сохраняли способность дифференцироваться в адипоциты, остеобласты и хондроциты. Профили секреции цитокинов клеток после противоточного центрифугирования были сопоставимы с предпротивоточным центрифугированием.
Убедитесь, что одноразовый комплект собран в соответствии с установкой кровати, переместите его в этом сборщике протоколов противоточной центрофузионной системы. Протокол для промывки остаточных примесей из конечного продукта может быть использован в клинических приложениях для поддержки пользователей в соблюдении критериев высвобождения партии. Чтобы ускорить процесс перекачки жидкости для крупномасштабной переработки, можно использовать внешние насосы для переноса трипсинизированного содержимого в перекачивающий мешок, а не непосредственно из многослойной колбы.
