A centrifugação de bancada é um processo aberto e manual que é desafiador de escalar. Nosso protocolo mostra como fechar e automatizar a dissociação, lavagem e coleta de células-tronco mesenquimais, ou CTMs, em uma única execução. A configuração é simples.
Todo o processo pode ser realizado fora do gabinete de biossegurança em uma instalação de classe cGMP. O processamento automatizado fechado de células reduz as etapas de manuseio manual que poderiam ser propensas a riscos e permite a conformidade com cGMP. Este método pode ser aplicado a outros tipos celulares expandidos em sistemas de cultura multicamadas.
O Sistema de Centrifugação em Contrafluxo permite a modificação de quaisquer etapas do protocolo para diferentes aplicações. Quem demonstrará esse procedimento será o Dr. Alan Lam, cientista da equipe do grupo de bioprocessamento de células-tronco do Instituto de Tecnologia de Bioprocessamento, uma estrela em Cingapura. Para iniciar a montagem do kit de centrifugação de contrafluxo de uso único, conecte o kit de uso único com os sacos de transferência de PVC de uso único por meio de soldagem de tubo, conforme descrito na imagem.
Em seguida, dentro de um gabinete de biossegurança, conecte um frasco multicamadas de 10 camadas contendo células-tronco mesenquimais humanas derivadas da Geleia da Wharton ou HMSCs Jelly da Wharton ao conjunto de tubos personalizados. Transfira o recipiente de cultura de 10 camadas anexado com o conjunto de tubulação personalizado para uma bancada e solde-o à linha E do kit de uso único. Também. soldar uma porta de amostra estéril à linha G do kit de uso único de alto fluxo.
Em seguida, conecte a linha de colheita H a uma isca estéril, equipada com uma seringa de 50 mililitros. Para configurar o funcionamento do instrumento, ligue o instrumento usando o botão de alternância na parte traseira do instrumento e conecte o laptop à porta USBC do instrumento usando o cabo USBC fornecido. Execute a Centrifugação de Contrafluxo, a Interface Gráfica do Usuário ou o software GUI na área de trabalho ou no menu Iniciar e faça login.
Em seguida, carregue o protocolo clicando no botão Selecionar um protocolo na página de boas-vindas principal. Em seguida, pressione o botão azul de destravamento no instrumento e abra a porta de vidro para carregar o kit de uso único montado no Sistema de Centrifugação de Contrafluxo. Comece pendurando os sacos nos ganchos do cabide em uma ordem que os alinhe melhor com as portas do tubo nas tiras do sensor de bolhas com o frasco multicamadas de 10 camadas colocado em um ângulo.
Alinhe o kit com os dois botões de localização do kit. Estique a tubulação da bomba ao redor da bomba peristáltica e pressione o conector em forma de bulbo branco no lugar. Conecte a câmara centrífuga levantando a alavanca de prata do suporte da câmara centrífuga de contrafluxo e prendendo-a devolvendo a alavanca à sua posição vertical.
Pressione a tubulação de cada porta do kit nas trilhas ao longo das tiras do sensor de bolhas. Feche a porta pressionando a trava da porta. Pressione o botão Iniciar na GUI.
Uma lista de verificação será exibida. Os quatro primeiros itens são verificações de instrumentos, enquanto os dois últimos são verificações de usuários. Neste ponto, verifique se as bolsas e conexões correspondem à imagem do kit e se as abraçadeiras manuais estão abertas.
Pressione Confirmar para mostrar a tela Entradas de protocolo. Defina o valor da caixa de diálogo de entrada de dados ou volume de colheita como 45 mililitros e pressione Confirmar. Pressione o botão verde Iniciar no instrumento para iniciar a execução do protocolo.
Uma vez concluído o priming inicial, certifique-se de que o meio gasto seja completamente bombeado para o saco de resíduos. Nas etapas de pausa marcadas na tabela de fluxo de trabalho, levante o frasco de várias camadas e agite-o para distribuir o buffer igualmente por todas as bandejas. Depois de concluído, coloque o frasco multicamadas de 10 camadas de volta em sua posição original de tração para as próximas etapas.
Nas etapas 20 e 23, certifique-se de que as células tripsinizadas sejam transferidas completamente para a bolsa intermediária. Misture bem o saco intermediário, manualmente, no passo 25. Na etapa 26, use uma seringa de isca de dois mililitros para coletar amostras através da porta de amostragem.
Nas etapas 29 e 30, verificar a formação estável do leito celular fluidizado. Deve ser como o leito celular fluidizado mostrado aqui. A corrida é concluída na etapa de rampa para parada, e todos os valores de pinça no Sistema de Centrifugação de Contrafluxo serão fechados automaticamente.
Após a conclusão da execução do protocolo, pressione o botão azul de desbloqueio no instrumento e abra a porta de vidro. Sele assepticamente a linha de colheita usando um selador de tubo de transporte manual e transfira cuidadosamente a seringa selada preenchida com a colheita de células concentradas para o gabinete de segurança biológica para contagem de células e criopreservação. Desconecte a câmara novamente usando a alavanca.
Puxe o conector da lâmpada para fora de seu encaixe e levante cuidadosamente o kit e descarte-o em um saco de risco biológico. Limpe o instrumento com lenços umedecidos a etanol e feche a porta. Finalmente, feche o aplicativo GUI primeiro antes de desligar o interruptor na parte traseira do instrumento.
As CTMs de geleia da Wharton proliferaram bem quando expandidas em mídias contendo e sem soro e sem xeno. No entanto, aqueles em meio livre de soro e xeno exibiram morfologia fusiforme semelhante a fibroblastos ligeiramente mais longa, com um tamanho celular médio maior de 17 mícrons, em comparação com 15 mícrons no meio de soro. Em ambas as mídias, nas três passagens, os HMSCs de geleia da Wharton atingiram consistentemente uma densidade celular máxima de cerca de 23.000 células por centímetro quadrado e um tempo de duplicação populacional de 34 horas.
Quando os HMSCs de geleia de Wharton foram expandidos em vasos de cultura de 10 camadas usando a centrifugação contrafluxo demonstrada, uma redução de volume de dez vezes foi alcançada, gerando concentrações celulares de até 5,3 milhões de células por mililitro. O protocolo consistentemente alcançou uma alta recuperação celular de cerca de 98% e uma alta viabilidade celular de cerca de 99% para três corridas independentes. Os HMSCs de Geleia da Wharton colhidos usando ambos os métodos exibiram perfis característicos de marcadores de superfície que são CD73, CD90 e CD105 positivos, bem como CD34 e CD45 negativos.
As células colhidas da centrifugação em contrafluxo exibiram um ensaio unitário de fibroblastos ou potencial de UFC semelhante à unidade formadora de colônias, em comparação com aquelas colhidas por centrifugação manual. Em ambos os métodos, as células mantiveram a capacidade de se diferenciar em adipócitos, osteoblastos e condrócitos. O perfil de secreção de citocinas das células pós-centrifugação em contrafluxo foi comparável ao da centrifugação pré-contrafluxo.
Certifique-se de montar o kit de uso único com referência à configuração da cama, desloque-o neste Construtor de Protocolo de Sistema de Centrifusão de Contrafluxo. O protocolo de lavagem de impurezas residuais do produto final pode ser utilizado em aplicações clínicas para auxiliar os usuários no cumprimento dos critérios de liberação de lotes. Para acelerar o processo de transferência de fluidos para processamento em larga escala, bombas externas podem ser usadas para transferir o conteúdo tripsinizado para um saco de transferência primeiro, em vez de colher diretamente do frasco de várias camadas.
