يسمح بروتوكولنا للمستخدمين بقياس نشاط ALDH1A1 ، وهو مؤشر حيوي للخلايا الجذعية باستخدام طرائق متنوعة تتراوح من قياس التدفق الخلوي إلى التصوير الجزيئي للخلايا الحية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذا النهج في أن تنشيط المسبار ينطوي على استجابة تحول تتميز بنسبة إشارة عالية إلى الخلفية ، بالإضافة إلى الكشف الانتقائي عن الشكل المتماثل ALDH1A1. سيوضح هذا الإجراء طلاب الدراسات العليا مايكل لي وسارة جاردنر ورودريغو تابيا هيرنانديز من مختبري.
للبدء ، قم باستنشاق وسائط النمو من الخلايا المستزرعة ذات الأهمية في شريحة غرفة البئر الثمانية. أضف 500 ميكرولتر لكل بئر من الوسائط الخالية من المصل المكملة بمسبار فلوروجيني انتقائي ثنائي الشكل أو مسبار تحكم غير تفاعلي. احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة ، انتقل إلى التصوير المجهري متحد البؤر على الفور. حدد موقع الخلايا عند تكبير 10 ×. قناة FITC وقنوات الضوء المرسلة مطلوبة لهذه التجربة.
حدد موقع الخلايا وركزها باستخدام قناة الضوء المرسلة للتركيز على نفس المستوى Z طوال التجربة لإزالة التحيز. اضبط طاقة الليزر وكسب FITC على الإعداد المناسب حيث تكون الإشارة من عينات التحكم AlDeSense AM قابلة للاكتشاف إلى الحد الأدنى ، مع الاستمرار في رؤية الإشارة في عينات AlDeSense AM. اضبط كل معلمة عن طريق تحريك الشريط المقابل.
قد يلزم ضبط الإعدادات عدة مرات لتحديد المعلمات الصحيحة. بمجرد التحسين ، أكمل بقية التجربة داخل خط الخلية هذا باستخدام معلمات متطابقة. التقط ثلاث صور لكل بئر ليصبح المجموع ثلاثة آبار لكل حالة معالجة واحفظ الصور.
تأكد من التركيز باستخدام قناة الضوء المرسلة فقط أثناء التبديل بين الطائرات والآبار لتجنب التحيز. بعد ذلك ، باستخدام برنامج معالجة الصور ، قم بتقسيم ملف CZI إلى قنوات مختلفة وحساب العدد الإجمالي للخلايا وخلايا الفلورسنت. لتحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة لنازعة هيدروجين الألدهيد 1A1 ، قسم عدد خلايا الفلورسنت على إجمالي عدد الخلايا في كل صورة.
عد بنفس الطريقة لكل صورة لتجنب المتغيرات المربكة. أخرج قارورة زراعة الخلايا T25 التي تحتوي على الخلايا المحفوظة في الحاضنة. أضف التربسين لانفصال الخلايا ، وعد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي.
ثم حبيبات الخلايا في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر عن طريق الطرد المركزي في 180G لمدة خمس دقائق عند 25 درجة مئوية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من مسبار ميكرومولار أو محلول مسبار تحكم في برنامج تلفزيوني. هز الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة لضمان التعرض المتساوي للصبغة.
بعد فترة الحضانة ، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 180 جم لمدة خمس دقائق عند 25 درجة مئوية. ثم أعد تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. قم بتشغيل الخلايا من خلال مصفاة خلية شبكية من النايلون 35 ميكرومتر على أنبوب يوضع على الجليد لإزالة كتل الخلايا التي قد تسد مقياس التدفق الخلوي.
قم بتشغيل أداة مقياس التدفق الخلوي وتشغيل بروتوكول بدء التشغيل. تحقق من وجود سائل غمد والخصر الفارغ. قم بتشغيل الخطوط باستخدام 10٪ مبيض وماء لمدة خمس دقائق لكل منها.
ثم قم بتشغيل حبات مراقبة الجودة لضمان الوظيفة المناسبة. في علامة تبويب الإعدادات، حدد التشتت الجانبي المبعثر الأمامي وFITC لمرشح التألق. ارسم مساحة تشتت أمامية مقابل رسم مساحة تشتت جانبية لمحتوى الخلية الرئيسي بالقرب من مركز الرسم البياني.
بعد ذلك ، ارسم منطقة تشتت أمامية ، مقابل رسم عرض تشتت أمامي للنطاقات الأفقية الضيقة التي تشير إلى المفردات. ثم ارسم منطقة FITC مقابل مخطط منطقة التشتت الأمامي لمراقبة توزيع الخلايا التي تم فرزها بواسطة مسبار الفلوروجينيك الانتقائي متساوي الشكل. بعد ذلك ، ارسم مدرجا تكراريا لمنطقة FITC لمراقبة التحول في عدد السكان بناء على FITC وحدد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لنازعة هيدروجين الألدهيد 1A1.
لتحسين طاقة ليزر FITC ، قم بتشغيل عينة باستخدام المسبار بحيث يكون الذيل الأيمن لمنحنى الرسم البياني بالقرب من إشارة منطقة FITC القصوى. قد يتعين تكرار خطوة تحسين طاقة الليزر عدة مرات ، ولكن لا ينبغي تغيير طاقة الليزر عبر العينات ، بمجرد تعيين إعداد للتجربة. بعد ذلك ، أضف عينة إلى الغربلة ، وقم بتشغيلها باستخدام مسبار التحكم.
يجب أن يكون التحول السكاني قابلا للملاحظة للكشف عن النطاق الديناميكي الأقصى. قم بتشغيل كل عينة لمدة 10،000 عدد تم إجراؤها في ثلاث نسخ. بعد الانتهاء من جمع العينات ، قم بتشغيل الخطوط بنسبة 10٪ مبيض وماء لمدة خمس دقائق لكل منها ، ثم أغلق الجهاز.
معالجة البيانات باستخدام برنامج قياس التدفق الخلوي وتمشي عدد الخلايا المطلوب. باستخدام اختيار بوابة المستطيل ، اضبط المشية السلبية لنازعة هيدروجين الألدهيد 1A1 ، بحيث تحدث أكثر من 99.5٪ من الأحداث في عينات مسبار التحكم داخل هذه البوابة. سيتم اعتبار الخلايا المتبقية ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 إيجابية.
ضع نفس البوابات على عينة المسبار. لتحديد عدد الأحداث التي تعتبر ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 سلبية و 1A1 إيجابية. تم تحديد متوسط عمليات تشغيل الطيات لكل خط خلية لتحديد إجمالي نشاط ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1.
تم تحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لنازعة هيدروجين الألدهيد 1A1 في كل خط خلية عن طريق ضبط قوة الليزر وكسبه. لتقليل الإشارة في عينة التحكم المعالجة AlDeSense AM ، تم تحسين إشارة التألق في الخلايا المعالجة AlDeSense AM. من خلال حساب عدد الخلايا الإيجابية لنازعة هيدروجين الألدهيد A1A ، تم تحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لنازعة هيدروجين الألدهيد A1A.
مع تطبيق مسبار الفلوروجينيك الانتقائي isoform ، تم تحديد عدد الخلايا الإيجابية لألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 داخل كل خط خلية عن طريق بوابات لأعلى 0.5٪ من ألمع الخلايا داخل مجموعة التحكم في AlDeSense AM. كشف تحليل لوحة خلايا سرطان المبيض عن النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لنازعة هيدروجين الألدهيد 1A1. من النتائج التي تم الحصول عليها من خطوط الخلايا السرطانية المختبرة ، يمكن الاستنتاج أن BG-1 لديه أدنى نشاط ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 وأقل عدد إيجابي من ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1.
بالإضافة إلى ذلك ، كشف التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي عن أكبر نسبة من الخلايا الإيجابية لنازعة هيدروجين الألدهيد 1A1 في خلايا Caov-3. لكن النشاط الكلي لخط الخلية كان ثالث أعلى نشاط فقط. بدلا من ذلك ، احتوت خلايا OVCAR-3 على ثالث أعلى عدد إيجابي من ألدهيد ديهيدروجيناز 1A1 ، لكنها أظهرت أعلى نشاط عام.
AlDeSense هو مسبار متعدد الاستخدامات وقابل للتعميم لتحديد الخلايا الجذعية السرطانية في خطوط الخلايا الخالدة وفي عينات المرضى. نأمل أن نراها كأداة تنبؤية في الإعداد السريري.
