Protokolümüz, kullanıcıların akış sitometrisinden canlı hücre moleküler görüntülemeye kadar çeşitli modaliteler kullanarak bir kök hücre biyobelirteci olan ALDH1A1 aktivitesini ölçmelerini sağlar. Bu yaklaşımın en büyük avantajları, prob aktivasyonunun, seçici ALDH1A1 izoform tespitinin yanı sıra yüksek sinyal-arka plan oranı ile karakterize edilen geri dönüş tepkisini içermesidir. Bu prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan Michael Lee, Sarah Gardner ve Rodrigo Tapia Hernandez lisansüstü öğrencileri olacak.
Başlamak için, sekiz kuyu odası slaytında ilgilenilen kültürlenmiş hücrelerden büyüme medyasını aspire edin. İki mikromolar izoform seçici florojenik prob veya reaktif olmayan bir kontrol probu ile desteklenmiş serum serbest ortam kuyucuğu başına 500 mikrolitre ekleyin. Slaydı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, hemen konfokal mikroskop görüntülemeye geçin. Hücreleri 10 x büyütmede bulun. Bu deney için FITC kanalı ve iletilen ışık kanalları gereklidir.
Önyargıyı ortadan kaldırmak için deneyin tamamı boyunca aynı Z düzlemine odaklanmak için iletilen ışık kanalını kullanarak hücreleri bulun ve odaklayın. Lazer gücünü ve FITC kazancını, AlDeSense numunelerinde sinyal görmeye devam ederken, kontrol AlDeSense numunelerinden gelen sinyalin minimum düzeyde algılanabildiği uygun ayara ayarlayın. İlgili çubuğu kaydırarak her parametreyi ayarlayın.
Doğru parametreleri tanımlamak için ayarların birkaç kez ayarlanması gerekebilir. Optimize edildikten sonra, aynı parametreleri kullanarak denemenin geri kalanını bu hücre satırında tamamlayın. Tedavi koşulu başına toplam üç kuyucuk için kuyu başına üç görüntü çekin ve görüntüleri kaydedin.
Önyargıyı önlemek için yalnızca düzlemler ve kuyular arasında geçiş yaparken iletilen ışık kanalını kullanarak odaklandığınızdan emin olun. Daha sonra, görüntü işleme yazılımını kullanarak CZI dosyasını farklı kanallara bölün ve toplam hücre sayısını ve floresan hücreleri sayın. Aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için, floresan hücrelerin sayısını her görüntüdeki toplam hücre sayısına bölün.
Değişkenleri karıştırmaktan kaçınmak için her görüntü için aynı şekilde sayın. İnkübatörde tutulan hücreleri içeren bir T25 hücre kültürü şişesi çıkarın. Hücre ayrılması için tripsin ekleyin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde, 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 180G'de santrifüjleme yoluyla pelet haline getirin. PBS'de iki mikromolar probun veya kontrol probu çözeltisinin bir mililitresindeki hücreleri tekrar askıya alın. Boyaya eşit maruz kalmayı sağlamak için hücreleri oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sallayın.
Kuluçka döneminden sonra, hücreleri 25 santigrat derecede beş dakika boyunca 180 G'de santrifüjleme yoluyla pelet edin. Daha sonra hücreleri 0.5 mililitre PBS'de tekrar askıya alın. Akış sitometresini tıkayabilecek hücre kümelerini çıkarmak için hücreleri 35 mikrometrelik bir naylon ağ hücre süzgecinden buz üzerine yerleştirilmiş bir tüpe geçirin.
Akış sitometresi cihazını açın ve başlangıç protokolünü çalıştırın. Kılıf sıvısı ve boş bel olup olmadığını kontrol edin. Hatları her biri beş dakika boyunca% 10 ağartıcı ve su ile çalıştırın.
Ardından, düzgün çalışmasını sağlamak için kalite kontrol boncuklarını çalıştırın. Ayarlar sekmesinde, floresan filtresi için ileri saçılma yan saçılımı ve FITC'yi seçin. Grafiğin merkezine yakın ana hücre popülasyonu için bir yan dağılım alanı grafiğine karşı bir ileri dağılım alanı çizin.
Ardından, teklileri gösteren dar yatay bantlar için ileri saçılma genişliği grafiğine karşı ileri saçılma alanı çizin. Ardından, izoform seçici florojenik açma probu tarafından sıralanan hücrelerin dağılımını gözlemlemek için bir ileri saçılma alanı grafiğine karşı bir FITC alanı çizin. Daha sonra, FITC'ye dayalı popülasyondaki değişimi gözlemlemek ve aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek için bir FITC alan histogramı çizin.
FITC lazer gücünü optimize etmek için, histogram eğrisinin sağ kuyruğu maksimum FITC alan sinyaline yakın olacak şekilde probla bir numune çalıştırın. Lazer gücü optimizasyonu adımının birden çok kez tekrarlanması gerekebilir, ancak bir deney için bir ayar belirlendikten sonra lazer gücü numuneler arasında değiştirilmemelidir. Daha sonra, eleğete bir numune ekleyin ve kontrol probu ile çalıştırın.
Maksimum dinamik aralığı ortaya çıkarmak için bir popülasyon kayması gözlemlenebilir olmalıdır. Her örneği üçlü olarak yapılan 10.000 sayım için çalıştırın. Numune toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hatları her biri beş dakika boyunca %10 ağartıcı ve su ile çalıştırın, ardından cihazı kapatın.
Akış sitometri yazılımını kullanarak verileri işleyin ve istenen hücre popülasyonunu yürüyün. Dikdörtgen kapı seçimini kullanarak, aldehit dehidrogenaz 1A1 negatif yürüyüşünü ayarlayın, böylece kontrol probu numunelerindeki olayların% 99,5'inden fazlası bu kapı içinde gerçekleşir. Kalan hücreler aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif olarak kabul edilecektir.
Aynı kapıları prob numunesine uygulayın. Aldehit dehidrogenaz 1A1 negatif ve 1A1 pozitif olarak kabul edilen olayların sayısını ölçmek. Her hücre hattı için ortalama kıvrım dönüşleri, toplam aldehit dehidrogenaz 1A1 aktivitesini ölçmek için belirlendi.
Aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesi, lazer gücü ve kazancı ayarlanarak her hücre hattında belirlendi. Kontrol AlDeSense ile muamele edilen numunedeki sinyali en aza indirmek için, floresan sinyali AlDeSense ile muamele edilen hücrelerde optimize edilmiştir. Aldehit dehidrogenaz A1A pozitif hücrelerin sayısı sayılarak, aldehit dehidrogenaz A1A pozitif hücrelerin yüzdesi belirlendi.
İzoform seçici florojenik probun uygulanmasıyla, aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücre popülasyonu, kontrol AlDeSense ile tedavi edilen popülasyondaki en parlak hücrelerin en üst% 0.5'ine geçitlenerek her hücre hattında ölçülmüştür. Yumurtalık kanseri hücrelerinin panelinin analizi, aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin yüzdesini ortaya koymuştur. Test edilen kanser hücre hatlarının elde edilen sonuçlarından, BG-1'in en düşük aldehit dehidrogenaz 1A1 aktivitesine ve en düşük aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif popülasyonuna sahip olduğu sonucuna varılabilir.
Ek olarak, konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi, Caov-3 hücrelerinde aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif hücrelerin en büyük yüzdesini ortaya koymuştur. Ancak hücre hattının genel aktivitesi sadece üçüncü en yüksek seviyedeydi. Alternatif olarak, OVCAR-3 hücreleri üçüncü en yüksek aldehit dehidrogenaz 1A1 pozitif popülasyonunu içeriyordu, ancak en yüksek genel aktiviteyi sergiledi.
AlDeSense, ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarında ve hasta örneklerinde CSC'leri tanımlamak için çok yönlü ve genelleştirilebilir bir probdur. Klinik ortamda prognostik bir araç olarak görmeyi umuyoruz.
