당사의 프로토콜을 통해 사용자는 유세포 분석에서 살아있는 세포 분자 이미징에 이르는 다양한 양식을 사용하여 줄기 세포 바이오마커인 ALDH1A1 활성을 측정할 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 프로브 활성화가 높은 신호 대 배경 비율을 특징으로 하는 턴어라운드 응답과 선택적 ALDH1A1 동형 검출을 포함한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 마이클 리, 사라 가드너, 로드리고 타피아 에르난데스 대학원생이 될 것입니다.
먼저, 8개의 웰 챔버 슬라이드에서 배양된 관심 세포로부터 성장 배지를 흡인한다. 2마이크로몰 이소폼 선택적 형광 프로브 또는 비반응성 대조군 프로브로 보충된 혈청 유리 배지의 웰당 500 마이크로리터를 추가합니다. 슬라이드를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
배양 후 즉시 컨포칼 현미경 이미징을 진행합니다. 10 x 배율로 셀을 찾습니다. 이 실험에는 FITC 채널과 투과광 채널이 필요합니다.
투과광 채널을 사용하여 세포를 찾고 초점을 맞춰 전체 실험 동안 동일한 Z 평면에 초점을 맞춰 편향을 제거합니다. 제어 AlDeSense AM 샘플의 신호가 최소한으로 감지되는 적절한 설정으로 레이저 출력과 FITC 게인을 조정하면서 AlDeSense AM 샘플에서 신호를 계속 볼 수 있습니다. 해당 막대를 밀어 각 매개변수를 조정합니다.
올바른 매개변수를 식별하기 위해 설정을 몇 번 조정해야 할 수도 있습니다. 최적화되면 동일한 매개 변수를 사용하여 해당 세포주 내에서 나머지 실험을 완료합니다. 처리 조건당 총 3개의 웰에 대해 웰당 3개의 이미지를 스냅하고 이미지를 저장합니다.
편향을 피하기 위해 평면과 웰 사이를 전환하는 동안에만 투과광 채널을 사용하여 초점을 맞추십시오. 그런 다음 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 CZI 파일을 다른 채널로 분할하고 총 세포 수와 형광 세포 수를 계산합니다. 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해, 형광 세포의 수를 각 이미지의 총 세포 수로 나눈다.
혼동 변수를 피하기 위해 각 이미지에 대해 동일한 방식으로 계산합니다. 배양기에서 유지된 세포가 들어있는 T25 세포 배양 플라스크를 꺼낸다. 세포 분리를 위해 트립신을 추가하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.
그런 다음 섭씨 25도에서 5분 동안 180G에서 원심분리하여 15밀리리터 원심분리기 튜브에 세포를 펠렛화합니다. 세포를 PBS 중의 2 마이크로몰 프로브 또는 대조군 프로브 용액의 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 염료에 균일하게 노출되도록 실온에서 60분 동안 세포를 흔든다.
배양 기간 후, 섭씨 25도에서 5분 동안 180 G에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 그런 다음 0.5 밀리리터의 PBS에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 35마이크로미터 나일론 메쉬 셀 스트레이너를 통해 얼음 위에 놓인 튜브에 세포를 실행하여 유세포 분석기를 막을 수 있는 세포 덩어리를 제거합니다.
유세포 분석기 기기를 켜고 시작 프로토콜을 실행합니다. 외장액과 빈 허리를 확인하십시오. 10% 표백제와 물로 각각 5분 동안 라인을 실행합니다.
그런 다음 적절한 기능을 보장하기 위해 품질 관리 비드를 실행하십시오. 설정 탭에서 형광 필터에 대해 전방 산란 측면 산란과 FITC를 선택합니다. 그래프 중앙 근처의 주 세포 집단에 대한 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 플롯을 그립니다.
다음으로, 싱글렛을 나타내는 좁은 수평 밴드에 대한 전방 산란 폭 플롯과 전방 산란 영역을 그립니다. 그런 다음 FITC 영역 대 순방향 산란 영역 플롯을 그려 이소폼 선택적 형광 생성 턴온 프로브에 의해 정렬된 세포의 분포를 관찰합니다. 다음으로, FITC 면적 히스토그램을 그려 FITC를 기반으로 모집단의 이동을 관찰하고 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 세포의 백분율을 결정합니다.
FITC 레이저 출력을 최적화하려면 히스토그램 곡선의 오른쪽 꼬리가 최대 FITC 영역 신호 근처에 오도록 프로브로 샘플을 실행합니다. 레이저 출력 최적화 단계는 여러 번 반복해야 할 수 있지만 실험을 위한 설정이 지정되면 샘플 전체에서 레이저 출력을 변경해서는 안 됩니다. 그런 다음 체에 샘플을 추가하고 제어 프로브로 실행합니다.
최대 동적 범위를 나타내기 위해 인구 이동을 관찰할 수 있어야 합니다. 각 샘플을 10, 000 카운트에 대해 세 번 실행합니다. 샘플 수집이 완료되면 10% 표백제와 물로 각각 5분 동안 라인을 가동한 다음 기기를 종료합니다.
유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 원하는 세포 집단을 보행합니다. 직사각형 게이트 선택을 사용하여 알데히드 탈수소효소 1A1 음성 보행을 설정하여 제어 프로브 샘플의 이벤트 중 99.5% 이상이 이 게이트 내에서 발생하도록 합니다. 나머지 세포는 알데히드 탈수소효소 1A1 양성으로 간주됩니다.
프로브 샘플에 동일한 게이트를 적용합니다. 알데히드 탈수소효소 1A1 음성 및 1A1 양성으로 간주되는 사건의 수를 정량화합니다. 각 세포주에 대한 평균 폴드 턴온을 결정하여 총 알데히드 탈수소효소 1A1 활성을 정량화하였다.
알데히드 탈수소효소 1A1 양성 세포의 백분율은 레이저 파워 및 게인을 조정하여 각 세포주에서 결정하였다. 대조군 AlDeSense AM 처리된 샘플에서 신호를 최소화하기 위해, 형광 신호는 AlDeSense AM 처리된 세포에서 최적화되었습니다. 알데히드 탈수소효소 A1A 양성 세포의 수를 계수하여, 알데히드 탈수소효소 A1A 양성 세포의 백분율을 결정하였다.
이소폼 선택적 형광 생성 프로브의 적용으로, 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 세포 집단은 대조군 AlDeSense AM 처리된 집단 내에서 가장 밝은 세포의 상위 0.5%에 대해 게이팅하여 각 세포주 내에서 정량화되었습니다. 난소암 세포의 패널 분석은 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 세포의 백분율을 밝혀냈다. 시험된 암 세포주의 얻어진 결과로부터, BG-1은 가장 낮은 알데히드 탈수소효소 1A1 활성과 가장 낮은 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 집단을 갖는다고 결론지을 수 있다.
또한, 컨포칼 이미징 및 유세포 분석은 Caov-3 세포에서 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 세포의 가장 큰 비율을 나타냈습니다. 그러나 세포주의 전반적인 활성은 세 번째로 높았습니다. 대안적으로, OVCAR-3 세포는 세 번째로 높은 알데히드 탈수소효소 1A1 양성 집단을 함유했지만, 가장 높은 전체 활성을 나타내었다.
AlDeSense는 불멸화 세포주와 환자 샘플에서 CSC를 식별하기 위한 다재다능하고 일반화 가능한 프로브입니다. 우리는 그것을 임상 환경에서 예후 도구로 보기를 희망합니다.
