Наш протокол позволяет пользователям измерять активность ALDH1A1, биомаркера стволовых клеток, используя различные методы, начиная от проточной цитометрии и заканчивая молекулярной визуализацией живых клеток. Основные преимущества этого подхода заключаются в том, что активация зонда включает в себя реакцию поворота, характеризующуюся высоким отношением сигнала к фону, а также селективное обнаружение изоформ ALDH1A1. Эту процедуру продемонстрируют Майкл Ли, Сара Гарднер и Родриго Тапиа Эрнандес, аспиранты из моей лаборатории.
Для начала аспирируйте питательную среду из культивируемых клеток, представляющих интерес, в восьмилунной камере. Добавьте 500 микролитров на лунку свободной среды сыворотки, дополненной двухмикромолярным изоформным селективным флуорогенным зондом или нереактивным контрольным зондом. Инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение 30 минут.
После инкубации немедленно приступайте к визуализации конфокального микроскопа. Найдите ячейки с 10-кратным увеличением. Для этого эксперимента необходимы канал FITC и каналы проходящего света.
Найдите и сфокусируйте ячейки, используя канал проходящего света, чтобы сфокусироваться на одной и той же плоскости Z на протяжении всего эксперимента, чтобы устранить смещение. Отрегулируйте мощность лазера и коэффициент усиления FITC до соответствующего значения, при котором сигнал от контрольных образцов AlDeSense AM минимально обнаруживается, сохраняя при этом сигнал в образцах AlDeSense AM. Отрегулируйте каждый параметр, сдвинув соответствующую полосу.
Возможно, настройки придется корректировать несколько раз, чтобы определить правильные параметры. После оптимизации завершите оставшуюся часть эксперимента в этой клеточной линии, используя идентичные параметры. Сделайте три снимка на лунку, чтобы получить в общей сложности три лунки на одно условие обработки, и сохраните изображения.
Убедитесь, что фокусировка выполняется с использованием канала проходящего света только при переключении между плоскостями и лунками, чтобы избежать смещения. Затем с помощью программного обеспечения для обработки изображений разделите файл CZI на разные каналы и подсчитайте общее количество ячеек и флуоресцентных ячеек. Чтобы определить процент положительных клеток альдегиддегидрогеназы 1A1, разделите количество флуоресцентных клеток на общее количество клеток на каждом изображении.
Подсчитайте одинаково для каждого изображения, чтобы избежать путаницы с переменными. Выньте колбу для культивирования клеток T25, содержащую клетки, хранящиеся в инкубаторе. Добавьте трипсин для отслоения клеток и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток.
Затем гранулируйте ячейки в 15-миллилитровой центрифужной пробирке центрифугированием при 180 г в течение пяти минут при 25 градусах Цельсия. Повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре двухмикромолярного зонда или контрольного зондового раствора в PBS. Качайте клетки при комнатной температуре в течение 60 минут, чтобы обеспечить равномерное воздействие красителя.
После инкубационного периода гранулируйте клетки центрифугированием при 180 г в течение пяти минут при 25 градусах Цельсия. Затем повторно суспендировать клетки в 0,5 миллилитра PBS. Пропустите клетки через 35-микрометровый сетчатый сетчатый сетчатый фильтр для клеток на трубку, помещенную на лед, чтобы удалить клеточные комки, которые могут засорить проточный цитометр.
Включите прибор проточного цитометра и запустите протокол запуска. Проверьте, нет ли жидкости в ножнах и пустой талии. Запустите линии с 10% отбеливателем и водой в течение пяти минут каждая.
Затем запустите бусины контроля качества, чтобы обеспечить правильную работу. На вкладке настроек выберите прямое рассеяние и FITC для флуоресцентного фильтра. Нарисуйте прямую область рассеяния по сравнению с графиком боковой площади рассеяния для основной популяции ячеек вблизи центра графика.
Затем нарисуйте область прямого рассеяния в сравнении с графиком ширины прямого разброса для узких горизонтальных полос, обозначающих синглеты. Затем нарисуйте график площади FITC по сравнению с областью прямого рассеяния, чтобы наблюдать за распределением клеток, отсортированных изоформным селективным флуорогенным зондом. Затем нарисуйте гистограмму площади FITC, чтобы наблюдать сдвиг популяции на основе FITC и определить процент положительных клеток альдегиддегидрогеназы 1A1.
Чтобы оптимизировать мощность лазера FITC, запустите образец с помощью зонда так, чтобы правый хвост кривой гистограммы находился вблизи максимального сигнала площади FITC. Этап оптимизации мощности лазера, возможно, придется повторять несколько раз, но мощность лазера не должна изменяться в разных образцах после того, как настройка была назначена для эксперимента. Затем добавьте образец в просеивание и запустите его с помощью контрольного зонда.
Сдвиг населения должен быть наблюдаемым, чтобы выявить максимальный динамический диапазон. Выполните каждую выборку для 10 000 подсчетов, выполненных в трех экземплярах. После завершения отбора проб запустите линии с 10%-ным отбеливателем и водой в течение пяти минут каждая, затем выключите прибор.
Обработайте данные с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии и пройдите желаемую популяцию клеток. Используя выбор прямоугольного затвора, установите отрицательную походку альдегиддегидрогеназы 1A1 так, чтобы более 99,5% событий в образцах контрольного зонда происходили в пределах этого затвора. Остальные клетки будут считаться положительными по альдегиддегидрогеназе 1A1.
Примените те же затворы к образцу зонда. Для количественной оценки количества событий альдегиддегидрогеназа считается 1А1 отрицательной и 1А1 положительной. Для количественной оценки общей активности альдегиддегидрогеназы 1A1 были определены средние повороты складок для каждой клеточной линии.
Процент положительных клеток альдегиддегидрогеназы 1А1 определяли в каждой клеточной линии путем настройки мощности и усиления лазера. Чтобы свести к минимуму сигнал в контрольном образце, обработанном AlDeSense AM, сигнал флуоресценции был оптимизирован в клетках, обработанных AlDeSense AM. Путем подсчета количества положительных клеток альдегиддегидрогеназы А1А определяли процент положительных клеток альдегиддегидрогеназы А1А.
С применением изоформного селективного флюорогенного зонда положительная популяция клеток альдегиддегидрогеназы 1A1 была количественно определена в каждой клеточной линии путем стробирования для верхних 0,5% самых ярких клеток в контрольной популяции, обработанной AlDeSense AM. Анализ панели клеток рака яичников выявил процентное содержание альдегиддегидрогеназы 1А1 положительных клеток. Из полученных результатов тестируемых линий раковых клеток можно сделать вывод, что BG-1 имеет самую низкую активность альдегиддегидрогеназы 1A1 и самую низкую альдегиддегидрогеназу 1A1-положительную популяцию.
Кроме того, конфокальная визуализация и проточная цитометрия выявили наибольший процент положительных клеток альдегиддегидрогеназы 1A1 в клетках Caov-3. Но общая активность клеточной линии была только третьей по величине. В качестве альтернативы, клетки OVCAR-3 содержали третью по величине альдегиддегидрогеназу 1A1-положительную популяцию, но проявляли самую высокую общую активность.
AlDeSense — это универсальный и обобщаемый зонд для идентификации ЦСК в иммортализированных клеточных линиях и в образцах пациентов. Мы надеемся увидеть его в качестве прогностического инструмента в клинических условиях.
