В этом протоколе описывается наше поколение органоидов кровеносных сосудов человека из плюрипотентных стволовых клеток. Эта технология может быть использована для изучения аспектов васкулогенеза, ангиогенеза, сосудистых заболеваний, а также сосудистых патологий. Воспроизводимость и высокая пропускная способность, а также его постоянство во многих различных линиях стволовых клеток являются сильными преимуществами этого метода.
Что касается их применения, некоторые из наших предыдущих исследований описывают использование органоидов кровеносных сосудов для изучения морфологических изменений сосудистой сети пациентов с диабетом и исследуют возможности медикаментозного лечения диабетической васкулопатии. Правильное поддержание исходной популяции стволовых клеток, предотвращение слипания агрегатов и обеспечение почти однородного диаметра агрегата - это важные факторы для создания хороших органоидов кровеносных сосудов. Начните генерацию агрегатов с использованием культивируемых плюрипотентных стволовых клеток человека или hPSCs, имеющих 70% слияние.
Используя пипетку или вакуумную систему, аспирируйте питательную среду и замените ее одним миллилитром реагента для диссоциации клеток, прежде чем инкубировать клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. Тем временем подготовьте необходимый объем агрегационной среды в конической трубке объемом 15 миллилитров, следуя рецептуре, указанной в текстовой рукописи. После инкубации клеток аспирируют реагент диссоциации клеток, прежде чем суспендировать клетки в одном миллилитре агрегационной среды.
Аккуратно пипеткой нанесите содержимое вверх и вниз, чтобы создать одноклеточную суспензию. Подсчитайте клетки с помощью автоматического устройства для подсчета клеток или под микроскопом и рассчитайте общее количество клеток, необходимых для образования агрегатов. Показания жизнеспособности клеток показывают одноклеточную суспензию с низким уровнем кластеров или без них.
Аспирируйте надосадочную жидкость из трубки и добавьте соответствующий объем клеточной суспензии в агрегационную среду в 15-миллилитровой полипропиленовой конической трубке высокой прозрачности и осторожно пипеткой разбавленную клеточную суспензию вверх и вниз, чтобы обеспечить однородное распределение клеток. Пипеткой вводят три миллилитра разбавленной клеточной суспензии в каждую желаемую лунку шестилуночной пластины для культивирования со сверхнизким прикреплением. Поместите тарелку в инкубатор и сведите к минимуму любые помехи, чтобы сохранить размер и форму агрегатов.
Подготовьте мезодерму, как описано в текстовой рукописи. Через 24 часа после посева клеток достаньте культуральную тарелку из инкубатора. Вращайте пластину круговыми движениями, чтобы накопить заполнители в центре каждой лунки.
С помощью пипетки объемом один миллилитр аккуратно перенесите агрегаты со средой из каждой лунки в соответствующую коническую трубку. Дайте заполнителям осаждаться в конических трубах при комнатной температуре в течение одного часа. После осаждения аспирируйте надосадочную жидкость пипеткой или высокочувствительным аспирационным насосом осторожно, не нарушая осевшие агрегаты.
Ресуспендируйте агрегаты в каждой пробирке, добавив два миллилитра среды для индукции мезодермы. Затем перенесите суспензию из каждой трубки обратно в соответствующую лунку шестилуночной культуральной пластины со сверхнизкой насадкой. Поместите тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и оставьте до четвертого дня.
На четвертый день выньте культуральную тарелку из инкубатора, затем встряхните пластину круговыми движениями, чтобы собрать агрегаты в центре каждой лунки. С помощью одномиллилитровой пипетки аккуратно перенесите агрегаты с окружающей средой из каждой лунки в соответствующую коническую трубку. Установите таймер на 30 минут, чтобы заполнители оседали в пробирках.
Как только агрегаты осядут, подготовьте культуральные пластины, как показано ранее, и поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия до шестого дня. Для заделки агрегата и индукции ростков сосудов приготовьте желаемый конечный объем раствора внеклеточного матрикса во время работы на льду. Пипетка 500 микролитров ECM в одну лунку 12-луночной пластины, чтобы сформировать первый слой сэндвича ECM.
Чтобы обеспечить эффективную полимеризацию первого слоя ECM, поместите планшет в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на два часа. Ближе к концу двухчасовой инкубации начинайте работать с агрегатами в культуральной тарелке. Соберите заполнители в центре каждой лунки, прежде чем использовать пипетку объемом один миллилитр, чтобы аккуратно перенести заполнители и среду из каждой лунки в соответствующую коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Дайте агрегатам отстояться в течение 10-15 минут перед аспирацией надосадочной жидкости. После этого держите конические трубки, содержащие заполнители, на льду в течение пяти минут. Работая быстро и осторожно, ресуспендируйте агрегаты в 500 микролитрах ECM без образования пузырьков.
С помощью пипетки нанесите суспензию агрегата ECM поверх уже полимеризованного первого слоя ECM внутри скважины в 12-луночном планшете. Тем временем подготовьте среду для проращивания, как описано в рукописи текста. После двух часов инкубации при температуре 37 градусов по Цельсию добавьте в лунку один миллилитр проращивающей среды, предварительно нагретой до 37 градусов по Цельсию, чтобы вызвать дифференциацию кровеносных сосудов.
Работая в стерильных условиях, используйте закругленный конец стерильного шпателя, чтобы ослабить матрицу прорастания ECM, содержащую сосудистые сети. Затем стерильными щипцами и закругленным концом стерильного шпателя аккуратно перенесите разрыхленный гелевый диск на крышку 10-сантиметровой чашки для культуры. Поместите гель на крышку под стереомикроскоп, настроенный на желаемое увеличение и фокусировку, и используйте стерильные иглы, чтобы вырезать отдельные сети кровеносных сосудов, пытаясь ограничить количество неваскуляризированного ECM, полученного в процессе.
Аккуратно перенесите изолированные органоиды обратно в одну лунку шестилуночной пластины со сверхнизкой насадкой, содержащей три миллилитра прорастающей среды. Затем, используя пипетку объемом в один миллилитр, перенесите отдельные органоиды в соответствующее количество лунок в пластину со сверхнизкой насадкой на 96 лунок. После переноса добавьте 200 микролитров предварительно подогретой среды для проращивания в каждую лунку 96-луночной пластины.
Через четыре-шесть дней после изоляции в 96-луночном планшете убедитесь, что органоиды обладают круглой и здоровой морфологией, прежде чем приступать к их фиксации и окрашиванию. Изображения ступенчатой прогрессии генерации органоида кровеносных сосудов человека, или hBVO, из hPSCs были получены в светлом поле. На нулевой день из культуры hPSC были получены агрегаты диаметром от 30 до 100 микрон.
Тонкие изменения в размере и форме агрегатов наблюдались при индукции мезодермы в первый день, которые еще больше изменились на четвертый день, когда агрегаты подверглись сосудистому праймингу. Почти радиально-симметричное раннее прорастание сосудов можно наблюдать на седьмой день, через день после встраивания агрегатов в матрицу прорастания. Здоровая морфология органоидов и продолжающееся прорастание сосудов наблюдались на девятый день, которые прогрессировали до прорастания сосудов на поздней стадии к 10-му дню, когда плотные клеточные структуры в органоидном центре почти исчезли.
Морфология, типичная для зрелых органоидов кровеносных сосудов человека, отчетливо наблюдалась к 15-му дню. Окрашивание зрелых hBVO на 15-й день показало обширную и связанную эндотелиальную сеть, которая была CD31-положительной и окруженной PDGFR-бета-положительными паразитами и SMA-положительным альфа-гладкомышечным актином. PDGFR-бета-положительные и SMA-положительные фресочные клетки, инкапсулирующие сети эндотелиальных сосудов, хорошо наблюдаются.
Также наблюдалась непрерывная коллагеновая IV-положительная базальная мембрана, обволакивающая сосудистые сети. Обеспечение надлежащей полимеризации внеклеточного матрикса на этапе встраивания имеет решающее значение для эффективного прорастания кровеносных сосудов. Исследователи использовали нашу технологию органоидов кровеносных сосудов для создания ранних сосудистых компартментов в уже установленных органоидных моделях, таких как мозг и почки, которые ранее были аваскулярными.
