Este protocolo descreve a nossa geração de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células estaminais pluripotentes. Esta tecnologia pode ser utilizada para estudar aspectos da vasculogênese, angiogênese, doenças vasculares, bem como patologias vasculares. A reprodutibilidade e a natureza de alto rendimento, bem como sua consistência em muitas linhagens diferentes de células-tronco, são fortes vantagens desta técnica.
Em termos de sua aplicação, algumas de nossas pesquisas anteriores delineiam o uso de organoides de vasos sanguíneos para estudar as alterações morfológicas da vasculatura de pacientes diabéticos e exploram caminhos de tratamento medicamentoso para vasculopatia diabética. Manter adequadamente a população inicial de células-tronco, evitar que os agregados se aglutinem e garantir um diâmetro de agregado quase homogêneo, esses são fatores essenciais para gerar bons organoides dos vasos sanguíneos. Iniciar a geração de agregados usando células-tronco pluripotentes humanas cultivadas, ou hPSCs, com 70% de confluência.
Usando uma pipeta ou um sistema de vácuo, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por um mililitro de reagente de dissociação celular antes de incubar as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Enquanto isso, prepare o volume necessário de meio de agregação em um tubo cônico de 15 mililitros, seguindo a formulação mencionada no manuscrito do texto. Após incubar as células, aspirar o reagente de dissociação celular antes de suspender as células em um mililitro de meio de agregação.
Pipete suavemente o conteúdo para cima e para baixo para criar uma suspensão de célula única. Conte as células usando um dispositivo automatizado de contagem de células ou sob um microscópio e calcule o número total de células necessárias para a formação de agregados. A leitura da viabilidade celular mostra suspensão de célula única com baixo ou nenhum aglomerado.
Aspirar o sobrenadante do tubo e adicionar o volume adequado da suspensão celular ao meio de agregação no tubo cônico de polipropileno de alta claridade de 15 mililitros e pipetar suavemente a suspensão de células diluídas para cima e para baixo para garantir uma distribuição celular homogênea. Pipetar três mililitros da suspensão de células diluídas em cada poço desejado da placa de cultura de fixação ultrabaixa de seis poços. Coloque a placa na incubadora e minimize qualquer perturbação para manter o tamanho e a forma dos agregados.
Preparar o meio mesodérmico conforme descrito no manuscrito do texto. 24 horas após a semeadura das células, retirar a placa de cultura da incubadora. Gire a placa em movimento circular para acumular os agregados no centro de cada poço.
Usando uma pipeta de um mililitro, transfira suavemente os agregados com o meio de cada poço para o tubo cônico correspondente. Deixar sedimentar os agregados nos tubos cônicos à temperatura ambiente por uma hora. Uma vez sedimentado, aspirar o sobrenadante com uma pipeta ou uma bomba aspiradora de alta sensibilidade cautelosamente, sem perturbar os agregados sedimentados.
Ressuspender os agregados em cada tubo adicionando dois mililitros de meio de indução mesodérmico. Em seguida, transfira a suspensão de cada tubo de volta para o respectivo poço da placa de cultura de seis poços de fixação ultrabaixa. Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e deixe até o quarto dia.
No quarto dia, retire a placa de cultura da incubadora e, em seguida, agite a placa em movimento circular para coletar os agregados no centro de cada poço. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira suavemente os agregados com o meio circundante de cada poço para o tubo cônico correspondente. Ajuste um temporizador por 30 minutos para permitir que os agregados sedimentem nos tubos.
Uma vez que os agregados sedimentam, prepare as placas de cultura como demonstrado anteriormente e coloque-as na incubadora a 37 graus Celsius até o sexto dia. Para incorporação de agregados e indução de brotos de vasos, prepare o volume final desejado da solução de matriz extracelular enquanto trabalha com gelo. Pipetar 500 microlitros do ECM em um poço de uma placa de 12 poços para formar a primeira camada do sanduíche ECM.
Para garantir a polimerização eficaz da primeira camada de ECM, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por duas horas. Ao final das duas horas de incubação, comece a trabalhar com os agregados na placa de cultura. Reúna os agregados no centro de cada poço antes de usar uma pipeta de um mililitro para transferir suavemente os agregados e o meio de cada poço para um tubo cônico correspondente de 15 mililitros.
Deixe os agregados assentarem por 10 a 15 minutos antes de aspirar o sobrenadante. Em seguida, mantenha os tubos cônicos contendo os agregados sobre gelo por cinco minutos. Trabalhando de forma rápida e cuidadosa, ressuspenda os agregados em 500 microlitros de ECM sem formação de bolhas.
Usando uma pipeta, coloque a suspensão de agregados ECM sobre a primeira camada de ECM já polimerizada dentro do poço na placa de 12 poços. Enquanto isso, prepare o meio de brotação, conforme descrito no manuscrito do texto. Após duas horas de incubação a 37 graus Celsius, adicione um mililitro de meio de brotação pré-aquecido a 37 graus Celsius no poço para induzir a diferenciação dos vasos sanguíneos.
Trabalhando em condições estéreis, use a extremidade arredondada de uma espátula estéril para soltar a matriz de brotamento da MEC que contém as redes vasculares. Em seguida, usando pinças estéreis e a extremidade arredondada de uma espátula estéril, transfira cuidadosamente o disco de gel solto para a tampa de uma placa de cultura de 10 centímetros. Coloque o gel sobre a pálpebra sob um estereomicroscópio ajustado para a ampliação e foco desejados e use agulhas estéreis para cortar as redes de vasos sanguíneos únicos, tentando limitar a quantidade de MEC não vascularizada obtida no processo.
Transfira suavemente os organoides isolados de volta para um poço de uma placa de seis poços de fixação ultrabaixa contendo três mililitros de meio de brotação. Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, transfira os organoides individuais para o número apropriado de poços em uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa. Uma vez transferido, adicione 200 microlitros de meio de brotação pré-aquecido em cada poço da placa de 96 poços.
Quatro a seis dias após o isolamento na placa de 96 poços, certifique-se de que os organoides possuam uma morfologia redonda e saudável antes de proceder à fixação e mancha. Imagens da progressão gradual da geração organoide dos vasos sanguíneos humanos, ou hBVO, a partir de hPSCs foram capturadas sob campo claro. No dia zero, agregados variando de 30 a 100 mícrons de diâmetro foram gerados a partir da cultura de hPSC.
Mudanças sutis no tamanho e na forma dos agregados foram observadas na indução do mesoderma no primeiro dia, que se alteraram ainda mais no quarto dia à medida que os agregados foram submetidos ao priming vascular. A brotação inicial dos vasos, quase radialmente simétrica, pode ser observada no sétimo dia, um dia após a incorporação dos agregados na matriz de brotação. A morfologia organoide saudável e o brotamento contínuo dos vasos foram vistos no nono dia, que progrediu para vasos em estágio avançado brotando no dia 10, quando as estruturas celulares densas no centro organoide quase desapareceram.
A morfologia típica de organoides de vasos sanguíneos humanos maduros foi claramente observada no 15º dia. A coloração de montagem total dos hBVOs maduros no dia 15 exibiu uma extensa e conectada rede endotelial que era CD31-positiva e circundada por parasitas PDGFR-beta-positivos e actina de músculo liso alfa-positiva para SMA. As células murais positivas para PDGFR-beta e SMA-positivas que encapsulam as redes vasculares endoteliais são bem observadas.
Membrana basal contínua positiva para colágeno IV envolvendo as redes vasculares também foi observada. Garantir uma polimerização adequada da matriz extracelular durante a etapa de incorporação é fundamental para a brotação eficaz dos vasos sanguíneos. Pesquisadores têm usado nossa tecnologia de organoides de vasos sanguíneos para gerar compartimentos vasculares precoces em modelos organoides já estabelecidos, como cérebro e rim, que antes eram avasculares.
