이 프로토콜은 만능 줄기 세포에서 인간 혈관 오가노이드 생성을 설명합니다. 이 기술은 혈관 형성, 혈관 신생, 혈관 질환 및 혈관 병리의 측면을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 재현성과 높은 처리량 특성, 그리고 다양한 줄기 세포주에 걸친 일관성은 이 기술의 강력한 장점입니다.
적용 측면에서 우리의 이전 연구 중 일부는 당뇨병 환자 맥관 구조의 형태학적 변화를 연구하기 위해 혈관 오가노이드를 사용하는 방법을 설명하고 당뇨병성 혈관병증에 대한 약물 치료 방법을 탐구합니다. 초기 줄기 세포 집단을 적절하게 유지하고, 응집체가 뭉치는 것을 방지하고, 거의 균질한 응집체 직경을 보장하는 것은 좋은 혈관 오가노이드를 생성하는 데 필수적인 요소입니다. 70%의 밀도를 갖는 배양된 인간 만능 줄기 세포(hPSC)를 사용하여 응집체 생성을 시작합니다.
피펫 또는 진공 시스템을 사용하여 배양 배지를 흡인하고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양하기 전에 1밀리리터의 세포 해리 시약으로 교체합니다. 한편, 텍스트 원고에 언급 된 공식에 따라 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 필요한 양의 응집 배지를 준비하십시오. 세포를 배양한 후, 1밀리리터의 응집 배지에 세포를 현탁시키기 전에 세포 해리 시약을 흡인합니다.
내용물을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 자동 세포 계수 장치 또는 현미경을 사용하여 세포 수를 계산하고 응집체 형성에 필요한 총 세포 수를 계산합니다. 세포 생존율 판독값은 클러스터가 낮거나 전혀 없는 단일 세포 현탁액을 보여줍니다.
튜브에서 상청액을 흡인하고 15밀리리터 고투명 폴리프로필렌 원추형 튜브의 응집 배지에 적절한 양의 세포 현탁액을 추가하고 희석된 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균질한 세포 분포를 보장합니다. 희석된 세포 현탁액의 3 밀리리터를 6-웰 초저부착 배양 플레이트의 각각의 원하는 웰에 피펫팅한다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 응집체의 크기와 모양을 유지하기 위해 방해를 최소화하십시오.
텍스트 원고에 설명 된대로 중배엽 매체를 준비하십시오. 세포의 파종 24 시간 후, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 플레이트를 원을 그리며 소용돌이 치면 각 우물의 중앙에 응집체가 축적됩니다.
1 밀리리터 피펫을 사용하여 각 웰에서 해당 원추형 튜브로 배지가있는 응집체를 부드럽게 옮깁니다. 응집체가 실온에서 1시간 동안 원뿔형 튜브에 침전되도록 합니다. 침전되면 침전된 응집체를 방해하지 않고 피펫 또는 고감도 흡인 펌프로 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
2 밀리리터의 중배엽 유도 매체를 추가하여 각 튜브의 응집체를 재현탁합니다. 다음으로, 각 튜브의 현탁액을 다시 초저 부착 6웰 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 섭씨 37 도의 인큐베이터에 접시를 놓고 4 일째까지 그대로 두십시오.
4일째 되는 날, 배양 접시를 인큐베이터에서 꺼낸 다음 접시를 원을 그리며 흔들어 각 웰 중앙에 응집체를 수집합니다. 1 밀리리터 피펫을 사용하여 주변 매체와 함께 응집체를 각 웰에서 해당 원추형 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 응집체가 튜브에 침전될 수 있도록 타이머를 30분으로 설정합니다.
응집체가 침전되면 이전에 시연된 대로 배양 플레이트를 준비하고 6일까지 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 응집체 포매 및 혈관 새싹 유도를 위해, 얼음 위에서 작업하는 동안 세포 외 기질 용액의 원하는 최종 부피를 준비하십시오. 500 마이크로리터의 ECM을 12-웰 플레이트의 하나의 웰에 피펫팅하여 ECM 샌드위치의 제1 층을 형성하였다.
첫 번째 ECM 층의 효과적인 중합을 보장하기 위해 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 2시간 동안 두십시오. 2 시간의 배양이 끝날 무렵, 배양 접시의 응집체 작업을 시작하십시오. 1밀리리터 피펫을 사용하여 각 웰의 응집체와 배지를 해당 15밀리리터 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮기기 전에 각 웰의 중앙에 응집체를 수집합니다.
상층액을 흡인하기 전에 응집체가 10-15분 동안 침전되도록 합니다. 그런 다음 골재가 들어 있는 원추형 튜브를 얼음 위에 5분 동안 보관합니다. 신속하고 신중하게 작업하여 기포 형성 없이 500마이크로리터의 ECM에 응집체를 재현탁합니다.
피펫을 사용하여 12-웰 플레이트의 웰 내부의 이미 중합된 제1 ECM 층 위에 ECM 응집체 현탁액을 적층합니다. 그 동안 텍스트 원고에 설명 된대로 발아 배지를 준비하십시오. 섭씨 37도에서 2시간 배양한 후 섭씨 37도로 예열된 발아 배지 1밀리리터를 웰에 넣어 혈관 분화를 유도합니다.
무균 상태에서 작업하려면 무균 주걱의 둥근 끝을 사용하여 혈관 네트워크를 포함하는 ECM 발아 매트릭스를 풉니다. 그런 다음 멸균 집게와 멸균 주걱의 둥근 끝을 사용하여 느슨한 젤 디스크를 10cm 배양 접시의 뚜껑에 조심스럽게 옮깁니다. 원하는 배율과 초점으로 조정된 실체 현미경으로 뚜껑에 젤을 놓고 멸균 바늘을 사용하여 단일 혈관 네트워크를 절단하여 이 과정에서 얻은 혈관화되지 않은 ECM의 양을 제한합니다.
분리된 오가노이드를 3밀리리터의 발아 배지를 함유하는 초저부착 6웰 플레이트의 한 웰로 다시 부드럽게 옮깁니다. 다음으로, 1 밀리리터 피펫을 사용하여, 단일 오가노이드를 초저 부착 96-웰 플레이트의 적절한 수의 웰로 옮긴다. 일단 옮겨지면, 200 마이크로리터의 예열 발아 배지를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다.
96웰 플레이트에서 분리한 후 4-6일이 지나면 오가노이드를 고정하고 염색하기 전에 오가노이드가 둥글고 건강한 형태를 갖는지 확인합니다. hPSC에서 생성된 인간 혈관 오가노이드(hBVO)의 단계적 진행 이미지를 명시야에서 캡처했습니다. 0일째에, 직경이 30 내지 100 미크론에 이르는 응집체가 hPSC 배양물로부터 생성되었다.
응집체의 크기와 모양의 미묘한 변화가 1일째 중배엽 유도 시 관찰되었으며, 이는 응집체가 혈관 프라이밍을 거치면서 4일째에 추가로 변화했습니다. 거의 방사상 대칭적인 초기 혈관 발아는 발아 매트릭스에 응집체를 매립한 다음 날인 7일째에 관찰할 수 있습니다. 건강한 오가노이드 형태와 지속적인 혈관 발아가 9일째에 나타났으며, 이는 오가노이드 중심의 조밀한 세포 구조가 거의 사라진 10일째까지 발아하는 후기 단계 혈관으로 진행되었습니다.
성숙한 인간 혈관 오가노이드의 전형적인 형태는 15일까지 명확하게 관찰되었습니다. 15일째에 성숙한 hBVO의 전체 마운트 염색은 CD31 양성이고 PDGFR 베타 양성 기생충 및 SMA 양성 알파-평활근 액틴에 의해 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타내었다. 내피 혈관 네트워크를 캡슐화하는 PDGFR-베타 양성 및 SMA 양성 벽화 세포가 잘 관찰됩니다.
혈관 네트워크를 감싸는 연속적인 콜라겐 IV-양성 기저막이 또한 관찰되었다. 포매 단계 동안 세포외 기질의 적절한 중합을 보장하는 것은 효과적인 혈관 발아에 매우 중요합니다. 연구원들은 우리의 혈관 오가노이드 기술을 사용하여 이전에 무혈성이었던 뇌 및 신장과 같이 이미 확립된 오가노이드 모델에서 초기 혈관 구획을 생성했습니다.
