يصف هذا البروتوكول طريقة تلألؤ كيميائي محسنة قائمة على L-012 للكشف عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في الوقت الفعلي عند استنباط PAMP في أنسجة الأرز. هذه الطريقة سهلة وموحدة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في ظل ظروف خاضعة لرقابة صارمة. سيكون إظهار هذا الإجراء على يينغ ، طالب دكتوراه من مختبري.
للبدء ، قم بتعقيم بذور الأرز المقشرة بنسبة 70٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة ، ثم باستخدام 40٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة ساعة واحدة. شطف البذور خمس مرات بالماء المعقم لإزالة الكلور المتبقي. في طريقة غمد الأرز ، قم بطلاء البذور مباشرة في وعاء زجاجي معقم باستخدام وسط Murashige و Skoog أو MS.
للوحة البذور في طريقة قرص الأوراق ، قم بوضعها على ألواح MS لمدة خمسة إلى سبعة أيام ثم زرعها في مصفوفة النمو أو التربة. تنمو الشتلات في غرفة النمو مع ضوء 12 ساعة ، 12 ساعة فترة الصورة المظلمة. قطع غمد من شتلات الأرز 10 أيام إلى ثلاثة أجزاء ملليمتر مع شفرة حلاقة حادة أو شفرة جراحية للمعالجة المسبقة قبل يوم واحد من فحص ROS.
ضع خمسة أجزاء غمد في بئر فردي من صفيحة عيار 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لمدة 10 إلى 12 ساعة. قطع أقراص الأوراق من نباتات الأرز التي يبلغ عمرها أربعة إلى ستة أسابيع باستخدام لكمة خزعة مع المكبس. قم دائما بقص أقراص الأوراق من الثلث الأوسط من الورقة الثانية من الحارث الرئيسي لتقليل تباين البيانات.
بعد ذلك ، ضع قرص ورقة واحدة في بئر فردي من صفيحة عيار 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لمدة 10 إلى 12 ساعة للمعالجة المسبقة. احتفظ بجميع أقراص الأوراق عائمة ومتجهة لأعلى في آبار صفيحة العيار الدقيق للمعالجة المسبقة للمياه لتجنب الاختلاف المرتبط بجانب الورقة. تحضير محلول الاستنباط من خلال الجمع بين 9.4 ملليلتر من 50 ميكرومولار Tris HCL ، و 400 ميكرولتر من محلول L012 ، و 100 ميكرولتر من بيروكسيديز فجل الحصان ، و 100 ميكرولتر من Flg22.
أضف 200 ميكرولتر من محلول الاستنباط إلى الآبار. ابدأ تشغيل البرنامج وانقر على زر التجارب لإنشاء بروتوكول جديد أو استخدام بروتوكول موجود. انقر فوق الإجراء في النافذة المنبثقة لإعداد اللوحة وحدد الآبار من اللوحة المراد مراقبتها.
انقر فوق بدء الحركة واضبط وقت التشغيل على 30 دقيقة أو أكثر ، حسب المتطلبات التجريبية. حدد الحد الأدنى للفاصل الزمني للحصول على القراءات بشكل متكرر قدر الإمكان. ولوقت التكامل ، اختر ثانية واحدة أو أكثر حسب شدة الإشارة.
انقر فوق التحقق من الصحة ، متبوعا ب حسنا لتأكيد الإعدادات ، ثم انقر فوق اكتشاف اللوحة الجديدة في النافذة المنبثقة وانتظر حتى يطالب البرنامج بمربع حوار لوحة التحميل. قم بإزالة الماء المقطر المزدوج بعناية من الآبار التي تحتوي على الأنسجة المعالجة مسبقا ، وتجنب أي تلف أو جفاف للأنسجة. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 200 ميكرولتر من محلول الاستنباط إلى الآبار التي تحتوي على الأنسجة.
ضع اللوحة المراد اختبارها على الناقل وابدأ الكشف. للحث على ROS بواسطة Flg22 ، تم استخدام أقراص الأوراق وأغماد بطول ثلاثة ملليمترات. تتم مراقبة توليد ROS لمدة 35 دقيقة.
تشير الأشرطة إلى وسائل الانحرافات المعيارية المحسوبة من خمسة تكرارات فنية. في الأرز ، تم اكتشاف الزيادة في إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية لأول مرة في دقيقة إلى دقيقتين ، وبلغت ذروتها في 10 إلى 12 دقيقة وعادت إلى خط الأساس في حوالي 30 إلى 35 دقيقة. تم حساب المبلغ الإجمالي ل ROS من المنحنى.
للحصول على المبلغ الإجمالي لقيم ROS ، قم بتطبيق الصيغة على مجموعات البيانات المقابلة لحساب ROS الذي تم إنشاؤه في كل فترة زمنية ، والتي يمكن دمجها عن طريق تطبيق مجموع الصيغة لحساب المبلغ الإجمالي الذي تم إنشاؤه. تم وضع ثقب واحد أو نصفين من قرص الأوراق في آبار صفيحة عيار 96 بئر معالجة مسبقا ب 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج لمدة 10 إلى 12 ساعة ثم معالجتها باستخدام Flg22 لتحريض ROS. قيم القراءة من عينتي نصف القرص أعلى بكثير من تلك الموجودة في قرص الورقة بالكامل.
في المتوسط ، تبلغ القيم الإجمالية من عينتي نصف القرص ما يقرب من 1.6 ضعف تلك الموجودة في قرص الورقة بالكامل ، وهو ما يتناسب مع طول الحافة ، وليس مع مساحة العينات. تدعم هذه النتيجة أن أنواع الأكسجين التفاعلية تتولد بشكل أساسي في الخلايا في موقع الجرح. عند محاولة هذا الإجراء ، اعمل مع الأنسجة برفق ولا تقم بإجراء تخفيضات إضافية قد تكون مصدرا لاختلاف البيانات.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عمليات فسيولوجية أخرى منتجة لأنواع الأكسجين التفاعلية في الأنسجة النباتية.
