פרוטוקול זה מתאר שיטה כימילומינסנציה אופטימלית מבוססת L-012 לזיהוי ייצור ROS בזמן אמת עם אליציטוט PAMP ברקמות אורז. שיטה זו קלה, סטנדרטית וניתנת לשחזור בתנאים מבוקרים היטב. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה און יינג, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לעקר את זרעי אורז dehusked עם 70% אתנול במשך דקה אחת, ולאחר מכן עם 40% hypochlorite נתרן במשך שעה אחת. שטפו את הזרעים חמש פעמים במים סטריליים כדי להסיר שאריות כלור. בשיטת נדן האורז, ישירות צלחת את הזרעים בכלי זכוכית סטרילי עם Murashige ו Skoog או MS בינוני.
כדי לצלחת את הזרעים בשיטת דיסק העלים, צלחת אותם על לוחות MS במשך חמישה עד שבעה ימים ולאחר מכן להשתיל אותם על מטריצת הצמיחה או הקרקע. לגדל את השתילים בחדר צמיחה עם 12 שעות אור ו 12 שעות צילום כהה. חותכים את הנדן משתילי אורז בני 10 ימים לשלושה מקטעים מילימטריים עם סכין גילוח חד או להב כירורגי לטיפול מקדים יום לפני בדיקת ROS.
מניחים חמישה קטעי נדן בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר 96 באר המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול למשך 10 עד 12 שעות. חותכים את דיסקיות העלים מצמחי אורז בני ארבעה עד שישה שבועות באמצעות ניקוב ביופסיה עם בוכנה. חתכו תמיד את דיסקיות העלים מהשליש האמצעי של העלה השני של העלה הראשי כדי להפחית את השונות בנתונים.
לאחר מכן, הניחו דיסק עלה אחד בבאר בודדת של צלחת מיקרוטיטר 96 באר המכילה 100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול למשך 10 עד 12 שעות לטיפול מקדים. שמור את כל דיסקיות העלים צפות ופונות כלפי מעלה בבארות של צלחת מיקרוטיטר לטיפול מקדים במים כדי למנוע שינויים הקשורים לצד העלה. הכן תמיסת אליסיטציה על ידי שילוב של 9.4 מיליליטר של 50 מיקרומולר Tris Hcl, 400 מיקרוליטר של תמיסת L012, 100 מיקרוליטר של פרוקסידז צנון סוס ו -100 מיקרוליטר של Flg22.
הוסף 200 מיקרוליטר של פתרון אליסיטציה לבארות. הפעל את התוכנה ולחץ על כפתור הניסויים כדי ליצור פרוטוקול חדש או להשתמש בפרוטוקול קיים. לחץ על הליך בחלון הקופץ כדי להגדיר את הצלחת ובחר את הבארות מהצלחת שיש לפקח עליה.
לחץ על התחל קינטי והגדר את זמן הריצה ל- 30 דקות או יותר, בהתאם לדרישות הניסוי. בחר מרווח זמן מינימלי כדי לקבל את הקריאות בתדירות גבוהה ככל האפשר. ועבור זמן אינטגרציה, בחר שנייה אחת או יותר בהתאם לעוצמת האות.
לחץ על אימות, ואחריו בסדר כדי לאשר את ההגדרות, ואז לחץ על זהה את הצלחת החדשה בחלון הקופץ והמתן עד שהתוכנה תבקש את תיבת הדו-שיח של צלחת הטעינה. הסר בזהירות את המים המזוקקים הכפולים מהבארות המכילות את הרקמות שטופלו מראש, תוך הימנעות מכל נזק לרקמות או התייבשות. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטר של פתרון אליסיטציה לבארות המכילות את הרקמות.
הניחו את הצלחת לבדיקה על המנשא והתחילו בזיהוי. כדי לגרום ל-ROS על ידי Flg22, נעשה שימוש בדיסקי עלים ובנדנים באורך שלושה מילימטר. דור ROS מנוטר במשך 35 דקות.
העמודות מציינות את אמצעי סטיות התקן המחושבות מחמש חזרות טכניות. באורז, העלייה בייצור ROS זוהתה לראשונה תוך דקה או שתיים, הגיעה לשיא תוך 10 עד 12 דקות וחזרה לקו הבסיס תוך 30 עד 35 דקות. הסכום הכולל של ROS חושב מהעקומה.
כדי להשיג את הסכום הכולל של ערכי ROS, החל את הנוסחה על ערכות הנתונים המתאימות כדי לחשב את ה- ROS שנוצר בכל מרווח זמן, שניתן לשלב על-ידי החלת סכום הנוסחה לחישוב הסכום הכולל שנוצר. חור בודד או שני חצאים של דיסקית עלה הוכנסו לבארות של צלחת מיקרוטיטר באר 96 שטופלה ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפול במשך 10 עד 12 שעות ולאחר מכן טופלה ב-Flg22 להשראת ROS. ערכי הקריאה משני חצאי הדיסק גבוהים בהרבה מאלה של דיסק העלה כולו.
בממוצע, הערכים הכוללים של שני חצאי דגימות הדיסק הם כמעט פי 1.6 מאשר מכל דיסק הדף, שהוא פרופורציונלי לאורך הקצה, לא לאזור הדגימות. תוצאה זו תומכת בכך ש-ROS נוצרים בעיקר בתאים באתר הפצע. כאשר מנסים לבצע הליך זה, יש לנתח עם הרקמות בעדינות ולא לבצע חתכים מיותרים שעלולים להוות מקור לשינויים בנתונים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל תהליכים פיזיולוגיים אחרים המייצרים ROS ברקמות הצמח.
