Este protocolo describe un método optimizado de quimioluminiscencia basado en L-012 para detectar la producción de ROS en tiempo real tras la obtención de PAMP en tejidos de arroz. Este método es fácil, estandarizado y altamente reproducible bajo condiciones firmemente controladas. Demostrando este procedimiento estará On Ying, un estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Para comenzar, esterilice las semillas de arroz descascarilladas con etanol al 70% durante un minuto, luego con hipoclorito de sodio al 40% durante una hora. Enjuague las semillas cinco veces con agua estéril para eliminar el cloro residual. En el método de vaina de arroz, emplate directamente las semillas en el recipiente de vidrio estéril con Murashige y Skoog o MS medio.
Para emplatar las semillas en el método del disco de hojas, colóquelas en placas de MS durante cinco a siete días y luego transplante a la matriz de crecimiento o al suelo. Cultive las plántulas en una sala de crecimiento con un período de fotos de luz de 12 horas y 12 horas oscuras. Corte la vaina de las plántulas de arroz de 10 días de edad en segmentos de tres milímetros con una cuchilla de afeitar afilada o una cuchilla quirúrgica para el tratamiento previo un día antes del ensayo ROS.
Coloque cinco segmentos de vaina en un pozo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de agua destilada doble durante 10 a 12 horas. Corte los discos de hojas de plantas de arroz de cuatro a seis semanas de edad usando un punzón de biopsia con un émbolo. Siempre corte los discos de hojas del tercio medio de la segunda hoja del timón principal para reducir la variación de datos.
A continuación, coloque un disco de hoja en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de agua destilada doble durante 10 a 12 horas para el tratamiento previo. Mantenga todos los discos de las hojas flotando y mirando hacia arriba en los pocillos de una placa de microtitulación para el tratamiento previo del agua para evitar la variación asociada al lado de la hoja. Prepare la solución de obtención combinando 9.4 mililitros de 50 micromolares Tris Hcl, 400 microlitros de solución L012, 100 microlitros de peroxidasa de rábano picante y 100 microlitros de Flg22.
Agregue 200 microlitros de solución de obtención a los pozos. Inicie el software y haga clic en el botón experimentos para crear un nuevo protocolo o utilizar un protocolo existente. Haga clic en procedimiento en la ventana emergente para configurar la placa y seleccionar los pocillos de la placa que se supervisarán.
Haga clic en iniciar cinética y establezca el tiempo de ejecución en 30 minutos o más, según los requisitos experimentales. Seleccione el intervalo mínimo para obtener las lecturas con la mayor frecuencia posible. Y para el tiempo de integración, elija un segundo o más dependiendo de la intensidad de la señal.
Haga clic en validar, seguido de Aceptar para confirmar la configuración, luego haga clic en detectar la nueva placa en la ventana emergente y espere a que el software muestre el cuadro de diálogo de la placa de carga. Retire cuidadosamente el agua doble destilada de los pozos que contienen los tejidos pretratados, evitando cualquier daño tisular o desecación. Utilice una pipeta multicanal para añadir 200 microlitros de la solución de obtención a los pocillos que contienen los tejidos.
Coloque la placa a probar en el portador y comience la detección. Para inducir ROS por Flg22, se utilizaron discos foliares y vainas de tres milímetros de largo. La generación de ROS se monitorea durante 35 minutos.
Las barras indican las medias de las desviaciones estándar calculadas a partir de cinco repeticiones técnicas. En el arroz, el aumento en la producción de ROS se detectó por primera vez en uno o dos minutos, alcanzó un máximo de 10 a 12 minutos y regresó a la línea de base en alrededor de 30 a 35 minutos. La cantidad total de ROS se calculó a partir de la curva.
Para obtener la cantidad total de valores ROS, aplique la fórmula a los conjuntos de datos correspondientes para calcular el ROS generado en cada intervalo de tiempo, que se puede combinar aplicando la suma de la fórmula para calcular la cantidad total generada. Se colocó un solo orificio o dos mitades de un disco foliar en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos pretratada con 100 microlitros de agua destilada doble durante 10 a 12 horas y luego tratada con Flg22 para la inducción de ROS. Los valores de lectura de las dos muestras de medio disco son mucho más altos que los de todo el disco de la hoja.
En promedio, los valores totales de las dos muestras de medio disco son casi 1,6 veces mayores que los de todo el disco de la hoja, que es proporcional a la longitud del borde, no al área de las muestras. Este resultado apoya que las ROS se generan principalmente en células en el sitio de la herida. Al intentar con este procedimiento, opere con pañuelos suavemente y no haga cortes adicionales que podrían ser una fuente de una variación de datos.
Este método se puede aplicar a cualquier otro proceso fisiológico productor de ROS en tejidos vegetales.
