이 프로토콜은 벼 조직에서 PAMP 유도 시 실시간으로 ROS 생성을 감지하기 위해 최적화된 L-012 기반 화학발광 방법을 설명합니다. 이 방법은 쉽고 표준화되어 있으며 엄격하게 제어된 조건에서 재현성이 높습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 연구실의 박사 과정 학생인 On Ying이 될 것입니다.
시작하려면 껍질을 벗긴 쌀 종자를 70 % 에탄올로 1 분 동안 살균 한 다음 40 % 차아 염소산 나트륨으로 1 시간 동안 소독합니다. 잔류 염소를 제거하기 위해 멸균 된 물로 씨앗을 5 번 헹굽니다. 쌀집 방법에서는 멸균 유리 용기의 씨앗을 Murashige 및 Skoog 또는 MS 배지로 직접 도금합니다.
잎 디스크 방법으로 씨앗을 플레이팅하려면 MS 플레이트에 5-7일 동안 플레이팅한 다음 성장 매트릭스 또는 토양에 이식합니다. 12 시간의 빛, 12 시간의 어두운 사진 기간이있는 성장실에서 묘목을 재배하십시오. ROS 분석 하루 전에 전처리를 위해 날카로운 면도날이나 수술용 칼날로 10일 된 벼 묘목의 칼집을 3mm 조각으로 자릅니다.
100 마이크로리터의 이중 증류수를 함유하는 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 5개의 시스 세그먼트를 10 내지 12시간 동안 배치한다. 플런저가 달린 생검 펀치를 사용하여 4-6 주 된 벼에서 잎 디스크를 자릅니다. 데이터 변동을 줄이기 위해 항상 주 경운기의 두 번째 잎의 중간 1/3에서 잎 디스크를 자릅니다.
다음에, 전처리를 위해 10 내지 12시간 동안 100 마이크로리터의 이중 증류수를 함유하는 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 하나의 리프 디스크를 놓는다. 잎 측면과 관련된 변화를 피하기 위해 물 전처리를 위해 모든 잎 디스크를 물 전처리를 위해 마이크로타이터 플레이트의 우물에 떠 있고 위로 향하게 유지하십시오. 9.4 밀리리터의 50 마이크로몰 트리스 Hcl, 400 마이크로리터의 L012 용액, 100 마이크로리터의 양 고추 냉이 과산화효소 및 100 마이크로리터의 Flg22를 혼합하여 추출 용액을 준비합니다.
200 마이크로 리터의 유도 용액을 웰에 첨가하십시오. 소프트웨어를 시작하고 실험 버튼을 클릭하여 새 프로토콜을 만들거나 기존 프로토콜을 사용합니다. 팝업에서 절차를 클릭하여 플레이트를 설정하고 플레이트에서 모니터링할 웰을 선택합니다.
키네틱 시작을 클릭하고 실험 요구 사항에 따라 런타임을 30분 이상으로 설정합니다. 가능한 한 자주 판독값을 얻으려면 최소 간격을 선택하십시오. 그리고 통합 시간의 경우 신호 강도에 따라 1초 이상을 선택합니다.
검증을 클릭한 다음 확인을 클릭하여 설정을 확인한 다음 팝업에서 새 플레이트 감지를 클릭하고 소프트웨어가 로드 플레이트 대화 상자를 표시할 때까지 기다립니다. 전처리된 조직이 들어 있는 웰에서 이중 증류수를 조심스럽게 제거하여 조직 손상이나 건조를 방지합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 200 마이크로리터의 유도 용액을 조직을 포함하는 웰에 추가합니다.
테스트할 플레이트를 캐리어에 놓고 감지를 시작합니다. Flg22에 의한 ROS를 유도하기 위해, 리프 디스크와 3밀리미터 길이의 외피를 사용하였다. ROS 생성은 35분 동안 모니터링됩니다.
막대는 5개의 기술 반복에서 계산된 표준 편차의 평균을 나타냅니다. 벼에서 ROS 생산의 증가는 1-2분 내에 처음 감지되었고, 10-12분에 최고조에 달했으며 약 30-35분 후에 기준선으로 돌아왔습니다. ROS의 총량은 곡선으로부터 계산되었다.
ROS 값의 총량을 얻으려면 해당 데이터 세트에 공식을 적용하여 각 시간 간격에서 생성된 ROS를 계산하고, 수식 합계를 적용하여 생성된 총 양을 계산하여 결합할 수 있습니다. 잎 디스크의 단일 구멍 또는 두 개의 반쪽을 100 마이크로리터의 이중 증류수로 10 내지 12시간 동안 전처리된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣은 다음, ROS 유도를 위해 Flg22로 처리하였다. 두 개의 절반 디스크 샘플의 판독 값은 전체 리프 디스크의 판독 값보다 훨씬 높습니다.
평균적으로 두 개의 절반 디스크 샘플의 총 값은 전체 리프 디스크의 총 값의 거의 1.6배이며, 이는 샘플의 면적이 아니라 가장자리 길이에 비례합니다. 이러한 결과는 ROS가 주로 상처 부위의 세포에서 생성된다는 것을 뒷받침한다. 이 절차를 시도할 때 티슈로 부드럽게 작동하고 데이터 변동의 원인이 될 수 있는 추가 절단을 하지 마십시오.
이 방법은 식물 조직에서 다른 ROS 생성 생리학적 과정에 적용할 수 있습니다.
