تم استخدام هذا البروتوكول السهل والقابل للتكرار بنجاح لعزل النوى عالية الجودة من كبد نموذج الفئران السليم والمريض ، وكذلك الكبد من الرئيسيات البشرية وغير البشرية. لا تتطلب هذه الطريقة سوى كمية صغيرة من مواد الأنسجة المجمدة. أيضا ، يعطي تحفيز درجة الكثافة تعليقا نوويا نظيفا للغاية مع الحفاظ على جميع أنواع الخلايا الرئيسية في الكبد في الإعداد النووي النهائي.
يمكن استخدام طريقة استخراج النوى هذه في عينات الكبد البشري المؤرشفة بيولوجيا المخزنة في البنوك الحيوية. ابدأ تجانس الأنسجة عن طريق قطع قطعة مكعب 2230 ملليغرام أو خمسة ملليمترات من أنسجة الكبد الموضوعة في طبق بتري على الثلج الجاف باستخدام مشرط مبرد مسبقا. انقل طبق بتري على الفور إلى الثلج الرطب وأضف ملليلتر واحد من محلول التجانس.
باستخدام المشرط البارد ، فرم الأنسجة قدر الإمكان ، مما يسمح لها بالشفط بطرف فتحة عريض ملليلتر. اجمع تعليق الأنسجة وانقله إلى خالط زجاجي مبرد مسبقا سعة 2 ملليلتر. اغسل طبق بتري ب 0.521 ملليلتر إضافي من محلول التجانس واجمع كل قطع الأنسجة المتبقية مع الحفاظ على كل شيء على الجليد.
ببطء وبعناية أداء خمس ضربات مع مدقة فضفاضة A على الجليد دون خلق فقاعات. تأكد من أن المدقة تتحرك بعناية من أعلى إلى أسفل الخالط مع كل ضربة. بعد ذلك ، قم بإجراء 10 إلى 15 ضربة بطيئة مع مدقة ضيقة B على الجليد دون إنشاء فقاعات.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتصفية التجانس من خلال مصفاة خلية 50 ميكرومتر أثناء نقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا. استخدم أكثر من مرشح أو أنبوب للتجانس الذي يحتوي على كمية عالية من كتل النسيج الضام. اشطف الخالط والمرشحات ب 0.521 ملليلتر إضافي من مخزن التجانس المؤقت لجمع جميع تجانسات الأنسجة تماما قبل الطرد المركزي المتدرج الكثافة.
بالنسبة لأجهزة الطرد المركزي المتدرجة الكثافة ، قم بالطرد المركزي للتجانس المصفى في جهاز طرد مركزي ثابت الزاوية مبرد مسبقا عند 1000 جم لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية. أثناء الحصول على الطرد المركزي للعينة ، قم بإعداد أنبوب سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 50٪ وأنبوب واحد سعة 2 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 29٪. ضع كلا الأنبوبين على الثلج.
ثم من تعليق جهاز الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات باستخدام مضخة تفريغ. أعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من محلول التجانس باستخدام طرف ماصة فتحة عريضة ملليلتر. ثم انقل 250 ميكرولترا من معلق النوى إلى أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 250 ميكرولتر من 50٪ يوديكسانول واخلطه برفق ودقة لتوليد تعليق نوى يوديكسانول بنسبة 25٪.
بعد ذلك ، انقل 500 ميكرولتر من معلق نوى اليوديكسانول بنسبة 25٪ إلى أنبوب مليلتر أنبوبي مبرد مسبقا يحتوي على 500 ميكرولتر من تخفيف اليوديكسانول بنسبة 29٪. قم بالطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح مبرد مسبقا عند 12،500 G لمدة 20 دقيقة ، مع ضبط الفاصل على إيقاف التشغيل. قبل اكتمال خطوة الطرد المركزي مباشرة ، أضف مثبطات الحمض النووي الريبي إلى مخزن تخزين النوى ، أو NSB أثناء المتابعة إلى خطوط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة.
بعد الانتهاء من الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات باستخدام مضخة تفريغ. أعد تعليق الحبيبات برفق في 100 إلى 300 ميكرولتر من NSB باستخدام طرف ماصة بفتحة عريضة ملليلتر واحد وانقل تعليق النوى إلى أنبوب نظيف مبرد مسبقا سعة 1.5 ملليلتر. عد النوى باستخدام محلول تريبان الأزرق مع مقياس الدم اليدوي واستخدم على الفور تعليق النوى الذي تم الحصول عليه لفحص جينوم النواة المفردة.
لفرز الخلايا القائمة على قياس التدفق الخلوي ، قم بتصفية تعليق النوى من خلال مرشح 50 ميكرومتر في فرز الخلايا المنشط بالفلورة المنشطة المبردة مسبقا أو أنبوب فاكس. استخدم فارز قياس التدفق الخلوي المزود بفوهة 100 ميكرومتر وقم بتحميل أنبوب الفاكس على فارز قبل معاينة العينة. قم بإعداد استراتيجية البوابة لفرز النوى ، بدءا من بوابة مبعثرة عن طريق رسم منطقة التشتت الأمامية مقابل منطقة التشتت الجانبية ، متبوعة بالارتفاع المخادع مقابل المنطقة المخادعة ، ثم العرض المخادع مقابل المنطقة المخادعة.
تصور ملف تعريف النوى الصيغة الصبغية على الرسم البياني للمنطقة المخادعة. للفرز إلى 96 أو 384 لوحة بئر ، اضبط تأخير القطرة وقم بتحسين محاذاة اللوحة باستخدام طريقة قياس الألوان. اضبط تبريد العينة وحامل اللوحة على أربع درجات مئوية مع تشغيل دوران العينة عند 300 دورة في الدقيقة.
قم بفرز النوى المفردة عند تركيز عينة يبلغ حوالي واحد في 10 إلى النوى الخامسة لكل ملليلتر بمعدل تدفق يتراوح من 200 إلى 500 حدث في الثانية. أظهر الفحص المجهري للنوى المستخرجة من الكبد المتجمد أن خطوة الطرد المركزي المتدرج الكثافة سهلت إلى حد كبير إزالة الحطام الخلوي والأنسجة غير المرغوب فيه. حافظت هذه المنهجية على جميع مستويات الصيغة الصبغية ، والتي تم التحقق من صحتها وقياسها كميا من خلال التحليل الخلوي.
لوحظت مقاييس عالية الجودة من البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام استخراج النوى. يمثل التقريب والإسقاط المتشعب الموحد عدد الأعداد عبر جميع النوى وأنواع الخلايا الرئيسية ، والتي لا يمكن تحديدها بثقة إلا من خلال النسخ النووي والتسلسل الضحل نسبيا. سمح هذا النهج بالتحقيق في عوامل النسخ الخاصة بالكبد والجينات المستهدفة النهائية المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للأجانب الحيوية.
أظهر النمط التكميلي للجينات المميزة مثل CYP2E1 المركزي و CYP2F2 المحيطة أن النوى المستخرجة احتفظت بمعلومات مهمة حول التبرع بالكبد. تم تسلسل مكتبة التعبير الجيني للحمض النووي الريبي إلى عمق 44،600 قراءة لكل نواة ومكتبة ATAC إلى عمق 43،500 قراءة لكل نواة. سمح تحليل أقرب جار مرجح تم إجراؤه لقياسات متعددة لكلتا الطريقتين ، RNA بالإضافة إلى ATAC ، باستخدام حزم Seurat و Signac بتحديد أنواع خلايا الكبد الرئيسية والثانوية والتعليق عليها دون تحيزات بارزة بسبب حجم الخلية أو الهشاشة النووية.
كما تم الكشف عن منظمات النسخ المنبع والجينات المميزة للتبرع بالكبد في هذه الطريقة. من المهم تجنب إنشاء الكثير من الفقاعات أثناء تجانس الأسفل عند تحريك المدقات لأعلى ولأسفل ، والالتزام بعدد السكتات الدماغية المشار إليها في البروتوكول.
