Este protocolo fácil e reprodutível foi usado com sucesso para isolar núcleos de alta qualidade de fígados modelo de camundongos saudáveis e doentes, bem como fígados de primatas humanos e não humanos. Este método requer apenas uma pequena quantidade de material de tecido congelado. Além disso, o incentivo ao grau de densidade dá uma suspensão nuclear muito limpa com todos os principais tipos de células no fígado preservados na preparação nuclear final.
Este método de extração de núcleos pode ser usado em amostras de fígado humano bioarquivadas que são armazenadas em biobancos. Comece a homogeneização do tecido cortando um pedaço de cubo de 2230 miligramas ou cinco milímetros de um tecido hepático colocado na placa de Petri em gelo seco usando um bisturi pré-resfriado. Transfira imediatamente a placa de Petri para o gelo molhado e adicione um mililitro de tampão de homogeneização.
Usando o bisturi frio, pice o tecido o máximo possível, permitindo que ele aspirar com uma ponta de orifício de um mililitro de largura. Recolha a suspensão de tecido e transfira-a para um homogeneizador de salto de vidro de dois mililitros pré-refrigerado. Lave a placa de Petri com um adicional de 0,521 mililitro de tampão de homogeneização e colete todos os pedaços de tecido restantes, mantendo tudo no gelo.
Lentamente e cuidadosamente execute cinco golpes com pilão solto A no gelo sem criar bolhas. Certifique-se de que o pilão se move cuidadosamente de cima para baixo do homogeneizador a cada braçada. Posteriormente, execute 10 a 15 movimentos lentos com pilão B apertado no gelo sem criar bolhas.
Uma vez feito, filtre o homogeneizado através de um filtro de células de 50 micrômetros enquanto o transfere para um tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro. Use mais de um filtro ou tubo para homogeneizados contendo uma grande quantidade de aglomerados de tecido conjuntivo. Lave o homogeneizador e os filtros com um tampão adicional de homogeneização de 0,521 mililitro para coletar completamente todos os homogeneizados do tecido antes da centrifugação do gradiente de densidade.
Para a centrifugação do gradiente de densidade, centrifugar o homogeneizado filtrado numa centrífuga de ângulo fixo pré-refrigerada a 1000 G durante oito minutos a quatro graus Celsius. Enquanto a amostra está sendo centrifugada, prepare um tubo de 1,5 mililitro contendo 250 microlitros de diluição de iodixanol a 50% e um tubo de dois mililitros contendo 500 microlitros de diluição de iodixanol a 29%. Coloque ambos os tubos no gelo.
Em seguida, a partir da suspensão da centrífuga, aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet usando uma bomba de vácuo. Ressuspeite o pellet em 250 microlitros de tampão de homogeneização usando a ponta da pipeta de orifício de um mililitro de largura. Em seguida, transfira 250 microlitros da suspensão de núcleos para um tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro contendo 250 microlitros de iodixanol a 50% e misture-o suave e completamente para gerar uma suspensão de núcleos de iodixanol a 25%.
Em seguida, transfira 500 microlitros da suspensão de núcleos de iodixanol a 25% para um tubo de mililitros de tubo pré-resfriado contendo 500 microlitros de diluição de 29% de iodixanol. Centrifugar o tubo em uma centrífuga de balde oscilante pré-resfriada a 12.500 G por 20 minutos, com a ruptura definida para desligar. Pouco antes de a etapa de centrifugação ser concluída, adicione os inibidores de RNAs ao buffer de armazenamento de núcleos, ou NSB, enquanto prossegue para os pipelines de sequenciamento de RNA de núcleo único.
Após a conclusão da centrifugação, aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet usando uma bomba de vácuo. Ressuspeite suavemente o pellet em 100 a 300 microlitros de NSB usando a ponta do pipete de orifício de um mililitro de largura e transfira a suspensão dos núcleos para um tubo de 1,5 mililitro pré-resfriado limpo. Conte os núcleos usando solução azul de tripano com um hemocitômetro manual e use imediatamente a suspensão de núcleos obtida para o ensaio de genômica de núcleo único.
Para a classificação celular baseada em citometria de fluxo, filtre a suspensão de núcleos através de um filtro de 50 micrômetros em uma classificação celular ativada por fluorescência de cinco mililitros pré-resfriada ou tubo de fax. Use um classificador de citometria de fluxo equipado com um bocal de 100 micrômetros e carregue o tubo de fax no classificador antes de visualizar a amostra. Configure a estratégia de bloqueio para a classificação de núcleos, começando com uma porta de dispersão plotando a área de dispersão para a frente versus a área de dispersão lateral, seguida por altura fraudada versus área fraudada e, em seguida, largura falsificada versus área fraudada.
Visualize o perfil de ploidia dos núcleos no histograma da área enganada. Para classificar em placas de 96 ou 384 poços, defina o atraso da gota e otimize o alinhamento da placa usando o método colormétrico. Ajuste o arrefecimento da amostra e o suporte da placa a quatro graus Celsius com a rotação da amostra ligada a 300 RPM.
Classifique os núcleos únicos em uma concentração de amostra de aproximadamente uma vez 10 para o quinto núcleo por mililitro com uma taxa de fluxo de 200 a 500 eventos por segundo. O exame microscópico dos núcleos extraídos de fígados congelados mostrou que a etapa de centrifugação do gradiente de densidade facilitou muito a remoção de detritos celulares e teciduais indesejados. Essa metodologia preservou todos os níveis de ploidia, o que foi validado e quantificado por análise citométrica.
Métricas de alta qualidade foram observadas a partir dos dados obtidos por meio da extração de núcleos. A aproximação e projeção uniformes da variedade representaram o número de contagens em todos os núcleos e os principais tipos de células, que podem ser identificados com confiança apenas com o transcriptoma nuclear e o sequenciamento relativamente raso. Esta abordagem permitiu a investigação de fatores de transcrição específicos do fígado e genes-alvo a jusante envolvidos no metabolismo de xenobióticos.
O padrão complementar de genes característicos, como o CYP2E1 percentral e o CYP2F2 periportal, mostrou que os núcleos extraídos retinham informações críticas sobre a doação hepática. A biblioteca de expressão gênica de RNA foi sequenciada a uma profundidade de 44.600 leituras por núcleo e a biblioteca ATAC a uma profundidade de 43.500 leituras por núcleo. Uma análise ponderada do vizinho mais próximo realizada para múltiplas medições de ambas as modalidades, RNA mais ATAC, usando os pacotes Seurat e Signac permitiu a identificação e anotação dos tipos de células hepáticas maiores e menores sem vieses proeminentes devido ao tamanho da célula ou fragilidade nuclear.
Os reguladores transcricionais a montante e os genes característicos da doação de fígado também foram detectados neste método. É importante evitar a criação de muitas bolhas durante a homogeneização de down ao mover os pilões para cima e para baixo, e manter o número de golpes indicados no protocolo.
