Bu kolay ve tekrarlanabilir protokol, yüksek kaliteli çekirdekleri sağlıklı ve hastalıklı fare modeli karaciğerlerden ve ayrıca karaciğerleri insan ve insan olmayan primatlardan izole etmek için başarıyla kullanıldı. Bu yöntem sadece az miktarda dondurulmuş doku materyali gerektirir. Ayrıca, yoğunluk dereceli indüksiyon, karaciğerdeki tüm ana hücre tiplerinin son nükleer hazırlıkta korunduğu çok temiz bir nükleer süspansiyon sağlar.
Bu çekirdek ekstraksiyon yöntemi, biyobankalarda depolanan biyoarşivlenmiş insan karaciğeri örneklerinde kullanılabilir. Önceden soğutulmuş bir neşter kullanarak kuru buz üzerinde Petri kabına yerleştirilen bir karaciğer dokusundan 2230 miligram veya beş milimetrelik bir küp parçasını keserek doku homojenizasyonuna başlayın. Petri kabını hemen ıslak buza aktarın ve bir mililitre homojenizasyon tamponu ekleyin.
Soğuk neşteri kullanarak, dokuyu mümkün olduğunca kıyın, bir mililitre genişliğinde bir delik ucu ile aspire edilmesine izin verin. Doku süspansiyonunu toplayın ve önceden soğutulmuş iki mililitrelik cam sıçrama Homojenizatörüne aktarın. Petri kabını ilave 0,521 mililitre homojenizasyon tamponu ile yıkayın ve her şeyi buz üzerinde tutarken kalan tüm doku parçalarını toplayın.
Kabarcıklar oluşturmadan buz üzerinde gevşek havaneli A ile yavaşça ve dikkatlice beş vuruş yapın. Havanenin her vuruşta homojenizatörün üstünden altına doğru dikkatlice hareket ettiğinden emin olun. Daha sonra, kabarcıklar oluşturmadan buz üzerinde sıkı havaneli B ile 10 ila 15 yavaş vuruş yapın.
İşiniz bittiğinde, homojenatı önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarırken 50 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Yüksek miktarda bağ dokusu kümeleri içeren homojenatlar için birden fazla filtre veya tüp kullanın. Homojenizatörü ve filtreleri ilave 0,521 mililitre homojenizasyon tamponu ile durulayarak yoğunluk gradyanı santrifüjlemeden önce tüm doku homojenatlarını iyice toplayın.
Yoğunluk gradyanı santrifüjleme için, filtrelenmiş homojenatı dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 1000 G'de önceden soğutulmuş sabit açılı bir santrifüjde santrifüj yapın. Numune santrifüj edilirken, 250 mikrolitre% 50 iyodiksanol seyreltme içeren 1.5 mililitrelik bir tüp ve% 29 iyodiksanol seyreltme içeren 500 mikrolitrelik bir iki mililitrelik tüp hazırlayın. Her iki tüpü de buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra santrifüj süspansiyonundan, bir vakum pompası kullanarak peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Bir mililitre genişliğindeki delikli pipet ucunu kullanarak peleti 250 mikrolitre homojenizasyon tamponunda tekrar askıya alın. Daha sonra çekirdek süspansiyonunun 250 mikrolitresini, 250 mikrolitre% 50 iyodiksanol içeren önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve% 25'lik bir iyodiksanol çekirdeği süspansiyonu oluşturmak için nazikçe ve iyice karıştırın.
Daha sonra,% 25 iyodiksanol çekirdeği süspansiyonunun 500 mikrolitresini, 500 mikrolitre% 29 iyodiksanol seyreltme içeren önceden soğutulmuş bir tüp mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü önceden soğutulmuş sallanan bir kova santrifüjünde 20 dakika boyunca 12.500 G'de santrifüj yapın ve mola kapanır. Santrifüjleme adımı tamamlanmadan hemen önce, tek çekirdekli RNA dizileme boru hatlarına ilerlerken RNA inhibitörlerini çekirdek depolama tamponuna veya NSB'ye ekleyin.
Santrifüjlemenin tamamlanmasından sonra, bir vakum pompası kullanarak peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Bir mililitre genişliğindeki delik pippet ucunu kullanarak peleti 100 ila 300 mikrolitre NSB'de nazikçe yeniden askıya alın ve çekirdek süspansiyonunu temiz bir önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Manuel hemositometre ile tripan mavisi çözeltisini kullanarak çekirdekleri sayın ve elde edilen çekirdek süspansiyonunu hemen tek çekirdek genomik testi için kullanın.
Akış sitometrisi tabanlı hücre sıralama için, çekirdek süspansiyonunu 50 mikrometrelik bir filtreden önceden soğutulmuş beş mililitrelik floresan aktif hücre sıralama veya faks tüpüne filtreleyin. 100 mikrometrelik bir nozul ile donatılmış bir akış sitometri sıralayıcısı kullanın ve numuneyi önizlemeden önce faks tüpünü sıralayıcıya yükleyin. Çekirdek sıralama için geçit stratejisini ayarlayın, ileri saçılma alanını yan saçılma alanına karşı çizerek bir saçılma kapısı ile başlayın, ardından aldatılmış yüksekliğe karşı aldatılmış alan ve ardından aldatılmış genişliğe karşı aldatılmış alan ile devam edin.
Aldatılmış alan histogramındaki çekirdek ploidi profilini görselleştirin. 96 veya 384 kuyucuk plakasına sıralamak için damlacık gecikmesini ayarlayın ve kolometrik yöntemi kullanarak plaka hizalamasını optimize edin. Numune soğutmasını ve plaka tutucusunu, numune dönüşü 300 RPM'de açıkken dört santigrat dereceye ayarlayın.
Tek çekirdekleri, saniyede 200 ila 500 olay akış hızına sahip mililitre başına yaklaşık bir kez 10 ila beşinci çekirdek numune konsantrasyonunda sıralayın. Dondurulmuş karaciğerlerden ekstrakte edilen çekirdeklerin mikroskobik incelemesi, yoğunluk gradyanı santrifüjleme adımının istenmeyen hücresel ve doku kalıntılarının uzaklaştırılmasını büyük ölçüde kolaylaştırdığını göstermiştir. Bu metodoloji, sitometrik analiz ile doğrulanan ve ölçülen tüm ploidi seviyelerini korudu.
Çekirdek ekstraksiyonu kullanılarak elde edilen verilerden yüksek kaliteli metrikler gözlenmiştir. Düzgün manifold yaklaşımı ve projeksiyonu, tüm çekirdekler ve ana hücre tipleri arasındaki sayım sayısını temsil ediyordu, bu da sadece nükleer transkriptom ve nispeten sığ dizileme ile güvenle tanımlanabilir. Bu yaklaşım, ksenobiyotiklerin metabolizmasında rol oynayan karaciğere özgü transkripsiyon faktörlerinin ve aşağı akış hedef genlerinin araştırılmasına izin verdi.
Persantral CYP2E1 ve periportal CYP2F2 gibi ayırt edici genlerin tamamlayıcı paterni, ekstrakte edilen çekirdeklerin karaciğer bağışı hakkında kritik bilgileri koruduğunu göstermiştir. RNA'nın gen ekspresyon kütüphanesi çekirdek başına 44.600 okuma derinliğe ve ATAC kütüphanesi çekirdek başına 43.500 okuma derinliğe kadar sıralandı. Seurat ve Signac paketleri kullanılarak her iki modalitenin, RNA artı ATAC'ın çoklu ölçümleri için yapılan ağırlıklı bir en yakın komşu analizi, hücre büyüklüğü veya nükleer kırılganlık nedeniyle belirgin önyargılar olmadan majör ve minör karaciğer hücre tiplerinin tanımlanmasına ve ek açıklamalarına izin verdi.
Yukarı akış transkripsiyonel düzenleyicileri ve karaciğer bağışının ayırt edici genleri de bu yöntemde tespit edildi. Havaneleri yukarı ve aşağı hareket ettirirken aşağı homojenizasyonu sırasında çok fazla kabarcık oluşturmaktan kaçınmak ve protokolde belirtilen vuruş sayısına bağlı kalmak önemlidir.
